Sedimentarea si centrifugarea

Sedimentarea si centrifugarea

I. Notiuni teoretice

1. Sedimentarea

Sedimentarea - Este o tehnica de separare ce se bazeaza pe diferenta de densitate dintre componentele amestecului. In practica medicala se utilizeaza nu numai ca tehnica de separare dar si ca o metoda de analiza (VSH - viteza de sedimentare a sangelui).

Pentru o intelegere mai buna a procesului se poate modela comportarea unei hematii in camp gravitational.

Sa consideram o suspensie de particule sferice de raza R si densitate r aflate intr-un lichid de densitate r₀ r<r₀). Asupra particulelor actioneaza urmatoarele forte:

- forta de greutate:

- forta Arhimedica:

- forta de frecare cu moleculele lichidului - forta de vascozitate; pentru particule sferice si viteze mici de deplasare, forta de vascozitate este data de legea lui Stokes:

unde:  este viteza, h coeficientul de vascozitate iar R raza particulei.

La echilibru dinamic rezultanta acestor forte este nula si particula coboara cu viteza constanta (figura 5.1).

Figura 5.1. Fortele ce actioneaza asupra unei particule

de raza R si densitate r aflata intr-un lichid de densitate r₀ r > r₀

T   (1)

Considerand unde L este spatiul parcurs in miscare rectilinie si uniforma iar t timpul de sedimentare, obtinem:

Dupa cum se constata din relatia (1) viteza de sedimentare depinde atat de marimea particulelor (R) cat si de interactiunea acestora cu lichidul in care se afla, prin coeficientul de vascozitate h

Sedimentarea poate fi deci folosita nu numai ca tehnica de separare a unor particule de interes dar si ca metoda de cercetare in vederea obtinerii unor informatii legate de aceste particule.

De mare importanta clinica este determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor. In tabelul urmator sunt prezentate valorile normale obtinute prin metoda Westergreen.

Referat: Vitaminele - surse alimentare de vitamine Referat: 41 de sfaturi pentru viata lunga recomandate de doctor

2. Centrifugarea

Centrifugarea - reprezinta o tehnica de separare a componentelor unui amestec cu densitati diferite sub influenta unui camp centrifugal.

Deoarece viteza de sedimentare pentru particule de marimea hematiilor, sau mai mici, este deosebit de scazuta, este necesara o metoda care sa creasca forta activa (greutatea in cazul sedimentarii). Astfel, in cazul centrifugarii, rolul fortei de greutate il joaca forta centrifuga.

Figura 5.2. Fortele ce actioneaza asupra unei particule

de raza R si densitate r aflata intr-un lichid de densitate r₀ r > r₀

Neglijand forta de greutate si considerand ca migrarea duce la cresterea razei traiectoriei circulare, avem urmatoarele relatii:

Prin integrare obtinem timpul necesar separarii:

.

Ultracentrifugarea - Pentru particule foarte mici cum ar fi proteinele plasmatice sedimentarea prin centrifugarea obisnuita este practic nerealizabila din cauza fenomenelor de difuzie. Sunt necesare in acest caz turatii deosebit de mari >15000rot/min.

Ultracentrifugele ce realizeaza aceste turatii trebuie sa fie bine stabilizate mecanic (pentru a evita fenomenul de 'batai' care ar duce la ruperea axului) si bine termostatate (pentru a impiedica degradarea termica).

Cand sistemul este monodispers apare o limita neta de separatie intre solvent si particulele dispuse la fundul eprubetei.

Cand sistemul este polidispers apar mai multe campuri si este necesara o ultracentrifugare fractionata. Se centrifugheaza pe rand la fiecare turatie de interes si se recolteaza sau sedimentul sau super-natantul.

II. Parte experimentala

A. Determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor

(metoda Westergreen)

Materiale necesare

-sange venos, 1.6 ml, recoltat pe anticoagulantul citrat trisodic 3.8%, in cantitate de 0.4 ml;

-materiale pentru punctie venoasa;

-eprubete de hemoliza;

-hemosedimentrul Westergren, alcatuit dintr-un stativ metalic prevazut cu pipete Westergren, de aproximativ 300mm lungime si 2.5-3mm diametru.

Mod de lucru

-se aspira cu seringa, in conditii sterile, o cantitate de 0.4ml citrat trisodic 3.8%;

-se punctioneaza vena pacientului si se aspira sange pana la diviziunea de 2ml;

-dupa omogenizare sangele se pune intr-o eprubeta de hemoliza;

-se aspira sangele in pipetele Westergren pana la diviziunea zero;

-se fixeaza pipetele in stativ (intr-o pozitie perfect verticala), apoi se noteaza timpul (momentul se start) si numele pacientului.

Citirea rezultatului se face la o ora si/sau la doua ore, valoarea fiind data de inaltimea coloanei de plasma aparuta in partea superioara a tubului exprimata in mm, pe unitate de timp.  

B. Centrifugarea sangelui

Materiale necesare

- seringa si ac pentru punctie venoasa

- eprubete de hemoliza

- stativ

- pipete gradate

- citrat trisodic 3,8%

- balanta de echilibrare

- ser fiziologic

- eprubete de centrifugare

Mod de lucru

-se recolteaza o cantitate de 5-6 ml sange dupa metoda descrisa anterior;

-se introduce in eprubeta de centrifugare 1ml citrat trisodic 3,8%, 4ml ser fiziologic si 5ml sange dupa care se aseaza eprubeta pe balanta de echilibrare;

-pe platanul opus se aseaza o eprubeta identica in care se introduce apa distilata pana la echilibrarea balantei;

-se aseaza cele doua eprubete in centrifuga in pozitii diametral opuse una fata de alta, se inchide capacul centrifugii si se regleaza la 2000rotatii/min, dupa care se centrifugheaza 2minute;

-se scoate eprubeta si se masoara deplasarea frontului eritrocitar, apoi se continua centrifugarea.

Probleme:

1._Cunoscand valorile fiziologice ale coeficientului de vascozitate la barbat η_B=0,047Kg/ms si la femeie η_F=0,043Kg/ms, densitatea eritrocitului ρ=1095Kg/m³ si a plasmei ρ_o=1027Kg/m³ calculati din formula vitezei de sedimentare cat ar trebui sa fie raza eritrocitului presupus sferic.

2._Determinati viteza de sedimentare a unor particule de creta suspendate intr‑un lichid si raza acestor particule presupuse sferice cunoscand ρ_apa=1 g/cm³, η_apa=1.05 10^‑3Kg/ms, ρ_creta=1,545 g/cm³.

3._Cunoscand raza particulei de creta determinata anterior, evaluati folosind modelul matematic al centrifugarii, timpul de centrifugare pentru aceste particule suspendate intr‑un mediu vascos (glicerina). Se cunosc:

- ν=1000rot/min, (500rot/min)

- η_glicerina=13,93 10^‑3Kg/ms

- ρ_glicerina=1,26 g/cm³

- ln(x₂/x₁)=0,143

Verificati experimental rezultatul obtinut.