Metode de diferentiere ale celulelor stem embrionare murine

Metode de diferentiere ale celulelor stem embrionare murine

Diferentierea reprezinta fenomenul prin care celulele stem embrionare murine isi capata proprietati caracteristice, specifice celulelor adulte. Momentul in care celula isi dobandeste fenotipul matur, terminandu-si procesul de diferentiere se numeste diferentiere terminala. Acest proces de diferentiere poate fi stimulat de factori cum sunt hormoni, citochine, saruri minerale si multe alte substante.

Cea mai utilizata tehnica este cea de modificare a conditiilor de crestere a celulelor stem embrionare, prin adaugarea unor factori de crestere la mediul de cultura sau prin modificarea compozitiei chimice a suprafetei pe care se dezvolta celulele stem embrionare.  In plus suplimentarea mediului de cultura cu factori de crestere specifici care activeaza / inactiveaza gene specifice de la nivelul celulei stem embrionare initiaza o serie de evenimente moleculare care induc diferentierea celulelor stem embrionare dupa un model anume (Wobus A., 2005).

In recipientele de cultura din plastic se pot adauga substante care sa stimuleze aderarea celulelor stem embrionare sau, din contra, sa o previna. In general, un substrat aderent impiedica interactiunea dintre celule fapt foarte important pentru initierea diferentierii. Un mediu neaderent permite celulelor stem embrionare sa interactioneze si sa formeze conglomerate celulare.

Interactiunile celula-celula sunt critice pentru dezvoltarea normala, permitand ca astfel de fenomene sa se desfasoare si in vitro si reprezinta o strategie fundamentala pentru inducerea diferentierii celulelor stem embrionare murine. Proteinele transmembranare responsabile de adeziunea intercelulara pot influenta activitatea nucleara, blocand diviziunea celulara si sinteza proteinelor responsabile de diviziune celulara (Wobus A., 2005).

Diferentierea spontana a celulelor stem embrionare se poate obtine cel mai usor prin sistarea adaugarii de LIF la mediul de cultura cu aparitia unei populatii heterogene diferentiate. Daca se doreste obtinerea unui anumit tip celular se poate utiliza un numar semnificativ de strategii. De exemplu DMSO (dimetilsulfoxid) si MTG (monotioglicerol) sunt utilizate cu precadere pentru inducerea diferentierii cardiace iar RA (acid retinoic) pentru diferentiere neuronala.

Concentratia crescuta de RA induce diferentierea neuronala, caracterizata prin expresia specifica a unor gene, proteine, canale ionice si receptori, dar supravietuirea si rata de dezvoltare a acestor celule este limitata. Datorita efectului tertogen al acidului retinoic aceasta substanta nu poate fi utilizata in terapie. De aceea protocoale alternative care includ mai multe trepte de diferentiere sunt utilizate pentru obtinerea celulelor neuronale progenitoare.

Diferetierea directionata se poate realiza deasemenea pe mai multe cai insa in general se realizeaza in placi de cultura ale caror suprafata este pretratata cu substante care favorizeaza atasarea, prevenind astfel diferentierea spontana a celulelor stem.

In placi de cultura cu suprafata netratata, in suspensie sau in picatura apar mici agregate numite corpusculi embrionari - embryoid body - EB. In aceste agregate datorita unor mecanisme intercelulare, aceste celule sunt induse iar rezultatul acestei inductii este inceperea diferentierii (Robert L., 2006). Prin adaugarea unor factori de crestere in mediul de cultura sunt activate anumite gene speciale care duc la diferentierea spre anumite tesuturi in vitro. Dupa formarea acestor EB, prin inlaturarea serului fetal se poate inhiba diferentierea pe linie mezodermala, iar adaugarea de factori de crestere din gama bFGF, EGF pot stimula cu precadere cresterea a celulelor precursoare neuronale.

Adaugarea de factori neurotrofici derivati din celule gliale (GDNF) neurturin (NT), TGFβ3, IL-1β favorizeaza deasemenea diferentierea neuronala. Din mesoderm se diferentieaza musculatura, sistemul cartilaginos, cel osos, sangele si tesuturile de legatura. Sangele si celulele endoteliale sunt primele tipuri de celule care se diferentieaza in timpul dezvoltarii embrionare la vertebrate in jurul zilei de 6,5, incepand cu formarea sacului vitelin, o membrana extraembrionara compusa din celule mezodermale adiacente si endodermale primitive. Celulele hematopoetice si vasele sanguine provin dintr-o celula progenitoare comuna hemangioblastului. Aceste celule ectodermale cultivate in vitro cu celule ES pot recapitula cu succes dezvoltarea mezodermala (Robert L., 2006).

Inducerea diferentierii celulelor ES in complexul EBs -chistic permite generarea de insule sanguine continand eritrocite, macrofage, etc. Aplicarea de ser fetal si citochine ca IL3 (interleukina 3), IL1, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) duce la obtinerea de celule hematopoetice, globuline z embrionice (βH1) si globuline adulte β (adultβ major globulin). Prin utilizarea liniei de celule OP9 cu activitate secretorie si cu activitate inductoare se poate induce dezvoltarea tuturor tipurilor de celule dar liniile eritroide, mieloide si limfoide a celor NK (natural killer). Fenotipul celulelor hematopoetice derivate din celule ES poate fi caracterizate prin expresia specifica a unor gene si antigene de suprafata, dar pentru definirea acestor celule se efectueaza teste de functionalitate.

Obtinerea cardiomiocitelor se poate initia prin prepararea agregatelor ce contin 400-800 de celule in prezenta unei concentratii crescute de ser fetal bovin. Aceste celule derivate prezinta caracteristici similare observate la cardiomiocite in culturi primare in vivo. Aceste celule au o contractibilitate caracteristica declansat de ionii specifici cardiaci si expresia canalelor ionice atasate de membrana. Cardiomiocitele pot sa se dezvolte spontan sau pot fi induse prin factori de diferentiere cum ar fi Cardiogenol, Dynorphin B, DMSO, RA. Expresia specifica a genelor cardiace specifice, proprietatiile electrofiziologice caracteristice si raspunsul cronotrop la agonisti adrenergici si muscarinici sunt tipice cardiomiocitelor. Aceste celule derivate din ES prezinta raspuns β adrenergic si modulare muscarinica specifica (Sian E. H., si col 2007).

Totusi protocoalele de diferentiere ale celulelor Es nu produc o cantitate suficienta de celule. In acest context descoperireae recenta ale semnalelor inductoare a endodermului reprezinta o cale important de generare de cardiomiocite pentru terapie. Cocultivarea de EB pulsatile cu celule ES duce deasemenea la obtinerea de cardiomiocite utilizabile cu success in terapia regenerativa (Mummery C., si col. 2002).

Cultivarea celulelor ES in sisteme rotative este deasemenea utilizata mai ales pentru generarea de celule ale endoteliului vascular. Adaosul acidului retinoic la mediul de cultura al impreuna cu dibutyryl cAMP determina formarea de celule muscular netede vasculare tipice pentru artere. Celulele ES murine se diferentieaza eficient si spre alte tipuri de celule ale liniei mezodermale incluzand celule mezenchimale din care deriva adipocitele, condrocitele, osteoblastele si miocitele. In toate aceste cazuri derivarea acestor tipuri de celule sunt induse cu factori de diferentiere specifici si pe substrat specific de cultura.

Diferentierea pe linie endodermala este utilizata mai ales pentru obtinerea de celule hepatice si pancreatice cu interes major pentru terapia bolilor hepatice si a diabetului. Celulele derivate din celule ES prezinta factori de transcriptie hepatice si proteine care pot fi integrate funtional cu succes in cazul transplantarii lor. Diferentierea cu succes si izolarea de celule hepatocite-like a fost demonstrata prin utilizarea transfectiei stabile cu gene reporter EGFP fuzionat intr-un promoter insulinic.

In contrast, prin diferentierea spontana a celulelor ES se poate obtine un numar redus (0,1%) de celule pancratice si hepatice. Deasmenea prin utilizarea transfectiei cu un plasmid continand promoterul Nkx6,1 se pot genera celule producatoare de insulina care dupa transplant duc la normalizarea glicemiei la animale cu diabet zaharat.

Pe langa aceasta s-au incercat protocoale de introducere a unor transgene in celulele stem embrionare pentru diferentierea controlata a acestora prin adaugarea de gene active in genomul celulei stem embrionare, care determina diferentierea celulei dupa un anumit model (Mummery C., si col.  2003).

Acest tip de stimulare a diferentierii este foarte exacta, dar trebuie cunoscuta sau identificata gena care va fi activata in diferite etape de diferentiere in vitro.

Prin utilizarea diferentierii in vitro s-a reusit obtinerea unor tesuturi care sunt identice functional si morfologic cu cele din organism. Dintre acestea tesuturi neuronale, muculare, celulele secretante pancreatice, celulele germinale presupun materie prima pentru terapia regenerativa.