Numaratoarea eritrocitelor: principiul metodei. variatii ale numarului de eritrocite

LUCRAREA PRACTICA

EXPLORAREA SERIEI ERITROCITARE. NUMARATOAREA ERITROCITELOR: PRINCIPIUL METODEI. VARIATII ALE NUMARULUI DE ERITROCITE. NUMARATOAREA DE RETICULOCITE. DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE SI A RH-ULUI. LEGILE TRANSFUZIEI

Numararea eritrocitelor (HEMOGRAMA)

Principiul metodei:

Sangele amestecat, in pipete speciale, cu lichid diluant este introdus intr-un hemocitometru, unde eritrocitele se numara pe o retea, intr-un volum precis determinat .

Materiale necesare:

-pipeta Potain pentru eritrocite care este alcatuita dintr-un tub capilar gradat prezentand doua notatii - 0,5; 1 - si o bula de dilutie cu o perla mobila de culoare rosie. Deasupra bulei de dilutie se afla notatia 101, capacitatea totala a pipetei fiind deci, de 101 volume.

-lichid de dilutie: lichidul Hayem, care dilueaza sangele, distruge leucocitele, impiedica coagularea si simpexa hematiilor. Lichidul pentru dilutia eritrocitelor trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

a)      sa fie izotonic, pentru a nu determina hemoliza sau ratatinarea eritrocitelor

b)      sa contina un fixator, care sa mentina forma eritrocitelor si sa impiedice autoliza si aglutinarea lor. In urgente, in cazul in care nu exista lichid Hayem preparat, se poate folosi serul fiziologic.

-camera de numarat (hemocitometru) - lama groasa de sticla pe care a fost gravata o retea cu dimensiuni cunoscute.

-Lamela de sticla, perfect plana si slefuita, de grosime 0.3-0.5 mm, folosita pentru delimitarea volumului camerei. Hemocitometrul a fost astfel construit asa incat prin aplicarea lamelei, intre suprafata pe care se afla gravata reteaua si suprafata lamelei sa se delimiteze un spatiu cu inaltimea de 1/10 mm (fig. 3-6).

-Microscop optic (obiectiv uscat, 10*0.7; 20*0.7 si iluminare slaba);

-Materiale necesare recoltarii sangelui capilar

Tehnica de lucru

1. Pregatirea camerei de numarat: se degreseaza camera de numarat, lamela, se lasa sa se usuce, dupa care se aplica lamela peste hemocitometru (umezind usor marginile), asa incat intre acestea sa se realizeze o buna aderenta obiectivata de prezenta inelelor de refractie Newton. Se fixeaza apoi camera pe platanul microscopului si se aduce suprafata pe care se afla gravata reteaua in axul otic al microscopului. Se coboara obiectivul cu ajutorul vizei macrometrice, acesta se ridica usor pana cand apare imaginea retelei; se clarifica imaginea cu ajutorul vizei micrometrice.
2. Recoltarea sangelui capilar.
3. Se aspira sange in pipeta pana la diviziunea 0.5 sau 1 (citirea se face cu pipeta in pozitie verticala). Daca sangele depaseste usor diviziunea, prin atingerea varfului pipetei cu o hartie de filtru, coloana de sange se poate potrivi exact la diviziunea dorita.
4. Se sterge sangele aderent la fata externa a pipetei si se introduce pipeta in flaconul cu lichid de dilutie Hayem. Se aspira lichidul pana la semnul 101. dilutia realizata este in functie de cantitatea de sange aspirata in pipeta. Astfel, daca pipeta este incarcata cu sange pana la notatia 0.5, dilutia este de 1/200, iar daca sangele a fost aspirat pana la diviziunea 1, dilutia va fi de 1/100. Capacitatea pipetei fiind de 101 volume, dilutiile obtinute vor fi totusi de 1/200 si respectiv 1/100, datorita faptului ca un volum de lichid diluant ramane in tubul capilar si nu participa la diluarea sangelui.
5. Dupa umplere, pipeta trebuie agitata, timp de 3 minute in pozitie orizontala, tinand-o intre police si index, pentru realizarea unui bun amestec.
6. Dupa agitare se indeparteaza din pipeta primele picaturi, acestea constituind lichidul de dilutie din tubul capilar.
7. Apoi, imediat, se face umplerea camerei de numarat cu o picatura din proba, prin apropierea varfului pipetei de marginea lamelei, lasand-o sa patrunda prin capilaritate in camera. Lichidul trebuie sa se distribuie rapid si omogen pe intreaga suprafata a retelei. Picatura de umplere trebuie sa nu fie nici prea mare pentru a se evita patrunderea lichidului in santurile laterale, deplasarea lamelei sub presiunea jetului, patrunderea bulelor de aer in camera, si nici prea mica pentru a fi suficienta pentru umplere. In caz contrar, operatia se repeta dupa stergerea camerei. Dupa umplere se asteapat cateva minut pentru sedimentarea elementelor pe cadrilaj si apoi se incepe numaratoarea.

Numararea eritrocitelor

Se numara eritrocitele din patratelele de 1/400  mm cuprinzand toate hematiile din interiorul patratelelor, iar pentru eritrocitele care se gasesc pe liniile cadrilajului, se numara numai cele de pe doua margini: stanga si superioara sau dreapta si inferioara (dar mereu aceleasi) pentru evitarea numararii de doua ori a aceluiasi eritrocit.

V.N. - 4 - 5,5 milioane eritrocite/mm³

Scaderile se numesc anemii, cresterile poliglobulii (policitemii).

VARIATII ALE NUMARULUI DE ERITROCITE

Variatii fiziologice:

1. Cresterea numarului de eritrocite - POLICITEMIE

absoluta - rezultatul cresterii masei eritrocitare totale

relativa - reducerea volumului plasmatic.

1. Policitemie relativa - hemoconcentratie, deshidratare (soc, arsuri severe,obstructie intestinala, varsaturi, diaree, abuz de diuretice)
2. Policitemie absoluta:

Policitemie primara (vera, familiala)

Policitemie secundara:

a.      secundara oxigenarii tisulare (policitemie fiziologica/ hipoxica)

policitemie de altitudine

boli pulmonare: cord pulmonar cronic, hipertensiune pulmonara primara

boli cardiace congenitale cianogene

sidroame de hipoventilatie: hipoventilatie alveolara primara, sinromul Pickwick, apneea de somn

hemoglobine anormale: ereditare/ dobindite (medicamente, substante chimice, fumat)

plicitemia familiala

b.      secundara productiei aberante de eritropoietina (policitemie nefiziologica)

boli renale: carcinomul renal si alte tumor renale, rinichiul polichistic, hidronefroza, stenoza de artera renala

carcinomul hepatic

leiomiomul si tumori fibroide uterine

boli endocrine: sindrom Cushing, hiperaldosteronism primar, tumori ovariene virilizante, feocromocitom

medicamente: androgeni, abuz de eritropoietina

Referat: Tehnologia obtinerii produselor de origine vegetala Lucrare: Determinarea aciditatii laptelui cu alcool etilic

policitemia familiala

Policitemie idiopatica

Medicamente: corticotropina, glucocorticoizii, danazol, eritropoietina, antitiroidienele, hidroclortiazida, pilocarpina, mycophenolatul.

NUMARATOAREA DE RETICULOCITE

Principiu:

Reticulocitele sunt eritrocite tinere care contin in interiorul lor resturi de acizi nucleici, dispuse ca o retea sau sub forma fragmentara. Dupa expulzarea nucleului eritrocitele ramin in maduva pina la 4 zile. Ele se maturizeaza complet in circulatia periferica in cca 1-2 zile dupa ce parasesc maduva osoasa, timp in care pierd complet capacitatea de sinteza proteica, iar sinteza de hemoglobina inceteaza. Numarul lor ofera informatii despre capacitatea medulara de a sintetiza eritrocite ca raspuns la o suprasolicitare fiziologica, cum este anemia. Reticulocitele se coloreaza printr-o tehnica de colorare supravitala cu albastru brilliant de cresyl.

Materiale:

singe recoltat pe EDTA

lama de sticla

colorantul: albastru brilliant de cresyl - 1g, Na citric - 0,4g, NaCl sol. 0,85 g/100 ml - 100ml

Tehnica:

Pe o lama se pune o picatura de colorant si o picatura de singe, care se amesteca cu o lama. Se asteapta 5 minute. Se intind frotiuri care se usuca la aer.

Se examineaza cu obiectivul cu imersie. In reticulocitele albastre palid verzui, se distinge clar reteaua reticulo-filamentoasa albastra intens. Ele au volum mai mare decit al eritrocitelor mature. Se numara reticulocitele la 500 sau 1000 de eritrocite. Rezultatele se exprima %.

Valori normale

Indicatii:

diferentierea anemiilor in: neregenerative si regenerative/ hiperregenerative

monitorizarea raspunsului la tratamentul de substitutie cu fier, acid folic, vitamina B 12

evaluarea eritropoiezei dupa transplant medular, in anemia aplastica indusa de medicamente citotoxice sau in cadrul tratamentului cu eritropoietina.

Variatii patologice:

Numarul de reticulocite indica daca anemia se datoreaza alterarii productiei eritrocitare sau pierderii de eritrocite in circulatie (prin singerare sau hemoliza).

1. Reticulocitoza - numar crescut de reticulocite - indicator de eritropoieza regenerativa (sub stimulare maduva produce de 6-8 ori mai mult fata de rata normala)
• Hemoragii acute - in functie de cantitatea de singe pierduta
• Anemia hemolitica: imuna, transfuzii de singe incompatibil, boli hemolitice ereditare (sferocitoza, eliptocitoza, defecte enzimatice), hemoglobinopatii (siclemie, talasemie), dobindite (anemia hemolitica microangiopatica, infectii - malarie, agenti chimici si medicamente, hemodializa, veninuri, bolihepatice)
• Tratamentul de substitutie cu fier, acid folic, vitamina B12
• Tratamentul cu eritropoietina
• Aplazia medulara indusa de medicamente citotoxice
2. Reticulocitopenie - numar scazut de reticulocite - in anemii non-regenerative: deficitul de fier/ folat/ vitamina B 12, aplazia medulara, anemia din bolile cronice, insuficienta medulara.

DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE

Termeni utilizati

AGLUTINOGEN = antigen care favorizeaza aglutinarea eritocitelor in prezenta anticorpului corespondent.

AGLUTININA = anticorp care provoaca aglutinarea eritocite purtatoare ale unui antigen (aglutinogen).

HEMOLIZA = distrugerea eritrocitelor, avind ca rezultat: anemie, hipotensiune, soc hemolitic, deces.

IZOGRUP = din acelasi grup, care se efectueaza cu acelasi grup sanguin.

Sunt 2 probe obligatorii care se realizeaza in tub sau pe lama.

Proba Beth- Vincent:determinarea aglutinogenului.

Materiale necesare:

-seruri hemotest:0, A, B

-lama de microscop sau tub de sticla de 12*100mm

-ser fiziologic

-pipeta Pasteur

-sange

-centrifuga

Metoda pe lama:

Tehnica de lucru:

Se pune cate o picatura de ser hemotest in ordinea B la stanga, A la mijloc si 0 la dreapta pe lama.

Se adauga cate o picatura de sange pe fiecare picatura de ser,cu ajutorul unei lame, care se intoarce pentru fiecare de ser hemotest.Se omogenizeaza prin amestecare.Picatura de sange trebuie sa fie de 10 ori mai mica decat cea de ser.

Miscarea lamei va fi lenta si rotativa.

Citirea se face in primele 2-3 minute cu ochiul liber.

Interpretarea rezultatelor:

1.Daca amestecurile raman uniform colorate in roz, nu a avut loc aglutinarea ceea ce inseamna ca sangele apartine grupei 0.

2.Daca apare aglutinare cu serurile 0 si B si lipsa de aglutinare cu serul A, serul de cercetat apartine grupei A.

3. Daca apare aglutinare cu serurile 0 si A si lipsa de aglutinare cu serul B,sangele de cercetat apartine grupei B.

4.Daca apare aglutinare cu toate 3 serurile, sangele de cercetat apartine grupei AB

B       A 0

Interpretarea rezultatelor:

Grupa 0 (I) - poseda in ser aglutininele si

Grupa A (II) - are pe eritrocite aglutinogenul A si in ser aglutinina heterologa

Grupa B (III) - are pe eritrocite aglutinogenul B si in ser aglutinina heterologa

Grupa AB (IV) - poseda pe eritrocite ambele aglutinogene A si B; nu poseda in ser nicio aglutinina.

Caracteristicile grupelor de sange :

FACTORI DE EROARE

1.Greseli datorate sangelui:

a) autoaglutinarea-se datoreaza aparitiei unui anticorp cu actiune aglutinanta asupra propiilor eritrcite ale bolonavului.

b) hemoliza eritrocitelor-poate inhiba total sau reduce fenomenul de aglutinare.

2.Greseli datorate serurilor hemotest:

a)ser hemotest cu titru slab

b)ser hemotest infectat

3.Greseli datorate serurilor test:

a)eritrocite infectate cu anumiti germeni

4.Greseli datorate nerspectarii regulilor de tehnica:

a)coagularea picaturii de sange

b)sange hemolizant

c)greseli datorate etichetarii gresite a serurilor sau eritrocitelor test.

SISTEMUL Rh

Principiu

Factorul Rh₀ (D) este un aglutinogen eritrocitar care se pune in evidenta prin fenomenul de aglutinare daca eritrocitele sunt puse in contact cu un ser ce contine anticorpi omologi lui, anticorpi anti- Rh₀ (D).

Materiale necesare

hemotest anti-Rh ;

pipete Pasteur ;

eritrocite cunoscute Rh+ si Rh-, in suspensie in serul propriu ;

lame de sticlǎ sau plǎci cu godeuri ;

termostat de 37°C ;

camerǎ umedǎ reprezentatǎ de o cutie Petri cu hartie de filtru umezitǎ in interior ;

tub de hemolizǎ ;

materiale necesare recoltǎrii sangelui capilar .

Tehnica de lucru

Se recolteazǎ sange capilar

Intr-un tub de hemolizǎ se pune cu ajutorul unei pipete Pasteur un ml de sange

Se lasǎ sǎ se coaguleze, dupǎ care cu varful pipetei se sparge cheagul si se aspirǎ eritrocitele in suspensie de ser propriu necesare determinǎrii. Se procedeazǎ identic pentru recoltarea eritrocitelor cunoscute Rh+ si Rh-.

Pe o lamǎ curatǎ si degresatǎ se pune o picaturǎ mare de ser anti-Rh care se amestecǎ (pentru omogenizare, cu ajutorul coltului unei lame), cu o picaturǎ din suspensia de eritrocite de cercetat (se va respecta proportia de 1/20). Pe alte douǎ lame se repetǎ aceeasi operatie cu eritrocite cunoscute Rh+ si Rh- (au rol de lame de control).

Lamele se aseazǎ in camera umedǎ (pentru evitarea uscǎrii picǎturilor) pe douǎ baghete de sticlǎ si se lasǎ la thermostat, la 37°C, timp de o orǎ.

Citirea se face dupǎ o orǎ, imprimand lamei miscǎri circulare. Dacǎ eritrocitele de cercetat au aglutinat cu serul anti-Rh, atunci persoana respectivǎ apartine grupei Rh+; dacǎ nu au aglutinat, atunci sangele este Rh-. In picǎturile lamelor de control, eritrocitele Rh pozitive trebuie sǎ fie aglutinate, iar cele Rh negative neaglutinate (fig. 10-3).

Interpretarea rezultatelor

Initial se citesc martorii; martorul pozitiv, format din eritrocite  Rh₀ (D) pozitive trebuie sa fie aglutinat; martorul negativ, format din eritrocite Rh₀ (D) negative nu trebuie sa fie aglutinat.

Celelalte cazuri se citesc si se interpreteaza ca martorii. Timpul de reactie a serului anti- Rh₀ (D) se fixeaza in functie de valabilitatea martorilor.

Frecventa in Romania:

Rh pozitiv - 85%

Rh negativ - 15%

Sistemul Rh - prescurtarea Rh provine de la o specie de maimute (Rhesus) la care s-a descris prima data factorul Rh. Pe baza sistemului Rh, globulele rosii umane au fost impartite in doua tipuri: cele care poseda antigenul sau factorul Rh (Rh pozitive) si cele care nu poseda acest antigen (Rh negative). Persoanele care au acest factor in sange se numesc Rh pozitive si reprezinta circa 85% din populatie, iar restul persoanelor de 15% care nu au acest factor se numesc Rh negative. In mod normal nu exista anticorpi (aglutinine anti-Rh) in serul uman care sa aglutineze propriile globule rosii ale persoanelor Rh pozitive. Dar in cazul unei transfuzii cu sange de la o persoana Rh pozitiva, la o persoana Rh negativa, in corpul acestei persoane se produc anticorpi anti-Rh, care cu ocazia unei a doua transfuzii cu sange Rh pozitiv, produc aglutinarea globulelor rosii ale donatorului, cu complicatii grave. Acelasi lucru se poate intampla si cand o femeie Rh negativa este insarcinata, copilul fiind Rh pozitiv.
Cu ocazia sarcinii, a nasterii, a avortului, sangele copilului trece prin placenta in sangele mamei dand nastere la anticorpi anti-Rh. Iar in timpul celei de-a doua sarcini acesti anticorpi ai mamei se combina cu globulele rosii ale fatului pe care le distruge (hemoliza), provocandu-i icter si anemie grava. Daca si mama si sotul sunt Rh negativi nu este nici un pericol pentru copil.

De asemenea, daca ambii soti sunt Rh pozitivi nu se produc anticorpi anti-Rh si daca nu exista nici un fel de urmari neplacute pentru copil. O mama Rh negativa care are un sot Rh pozitiv poate da nastere unui copil Rh pozitiv in 85% din cazuri si unui copil Rh negativ in 15% din cazuri. Daca copilul este Rh negativ, ca si mama, nu are nici o importanta pentru nasterile urmatoare. Dar daca copilul este Rh pozitiv (ca si tatal) atunci el poate cu ocazia primei nasteri sa-si imunizeze mama (Rh negativa) cu anticorpi anti-Rh ca si in cazul unei transfuzii cu sange Rh pozitiv. In acest caz, copiii Rh pozitivi nascuti ulterior vor avea de suferit de complicatiile amintite. De aceea, toate femeile gravide trebuie sa-si faca analiza pentru factorul Rh, iar in cazul in care ele sunt Rh negative trebuie sa-si faca Rh-ul si sotii.          Daca sotii sunt Rh pozitivi, atunci ele sunt luate in evidenta pentru observatie si tratament in vederea preintampinarii complicatiilor ce ar putea apare la copii. Tot in scopul preintampinarii acestor complicatii se determina Rh-ul la fetele care urmeaza sa faca transfuzie de sange. Daca ele sunt Rh negative trebuie sa primeasca un sange identic. Pentru ca daca primesc sange Rh pozitiv ele vor forma anticorpi anti-Rh, care vor actiona asupra copilului atunci cand vor fi gravide. In unele situatii, mama Rh negativa cu copil Rh pozitiv poate avea anticorpi anti-Rh nu numai in sange ci si chiar in lapte, in acest caz se contraindica alaptarea

TRANSFUZIA

Lichidul ideal pentru transfuzie este sangele integral.

Globulele rosii ale sangelui transfuzionate supravietuiesc si isi pastreaza functiile in medie 80 de zile dupa injectarea lor.

Un pericol ce poate avea loc oricand este incompatibilitatea.Totdeauna trebuie efectuat testul compatibilitatii intre sangele primitorului si cel al donatorului.

Aglutinarea se produce la amestecarea sangelui a 2 persoane ce apartin unor grupe de sange diferit.

Sistemul AB0 este important pentru ca antigenele sunt cele mai puternice si pentru ca lor le corespund anticorpi speciali naturali: aglutininele alfa si beta.

Stabilirea compatibilitatii:

Grupa 0(aglutinina alfa si beta) primeste sange izogrup si doneaza grupelor 0,A,B,AB(donator universal).

Grupa A(II)( aglutinina beta) primeste de la 0(I) , A(II) si doneaza grupei AB(IV),A(II).

Grupa B(III)( aglutinina alfa) primeste de la 0(I),B(III) si doneaza grupeiAB(IV),B(III)

Grupa AB(IV) primeste de la 0, A, B ,AB(primitor universal) si doneaza catreAB(IV).