Determinarea curbei de crestere

Determinarea curbei de crestere

Curba de crestere este impartit conventional in 3 faze:

Faza de lag. Aceasta faza corespunde timpului dupa sub-cultivare si re-insamantare pe parcursul caruia se evidentiaza o mica crestere a numarului de celule. Este o perioada de adaptare in timpul careia celula reface elementele de suprafata celulara si matricea extracelulara pierdute in timpul tripsinizarii, se fixeaza de substrat si se etaleaza.

Faza log Aceasta faza este perioada de crestere exponentiala a numarului de celule ce urmeaza perioadei de lag. Lungimea fazei log depinde de densitatea de insamantare, rata de crestere a celulelor si densitatea care inhiba proliferarea celulara.

Faza de platou Catre sfarsitul fazei log, culturile devin confluente - toata suprafata de crestere este ocupata si toate celulele sunt in contact cu celulele inconjuratoare. In acest stadiu, culturile intra in faza de platou sau faza stationara sau pasiva (quiescent cells),

Fig. 21. Curba de crestere a celulelor in cultura. Reprezentarea semilogaritmica a cresterii concentratiei celulare (axa din stanga) si densitatii celulare (axa din dreapta) dupa sub-cultivare, din culturi recoltate zilnic si numarate.

Eficienta de clonare

Formarea de colonii la insamantarea de celule la densitati celulare mici este expresia eficientei de clonare. Aceasta tehnica evidentiaza diferente in viteza de crestere in cadrul unei populatii celulare si distinge intre modificari in viteza de crestere (marimea coloniei) si supravietuirea celulara (numarul de colonii). Trebuie avut in vedere insa ca celulele pot creste diferit la densitati celulare mici sub forma de colonii izolate. In aceasta situatie, mai putine celule vor supravietui chiar in conditii ideale si interactiile celulare sunt pierdute pana se vor forma colonii. Heterogenitatea in vitezele de crestere clonala reflecta diferente in capacitatea de proliferare celulara intre descendentii din cadrul unei populatii dar aceste diferente nu sunt exprimate in mod necesar intr-un monostrat ce interactioneaza la densitati celulare mai mari cand comunicarea celulara este posibila. Cand celulele sunt insamantate la densitati celulare mici (2-50 celule/cm²) ca o suspensie uni-celulara, ele cresc sub forma de colonii discrete.

Numarul acestor colonii poate fi folosit pentru a exprima eficienta de clonare:

Numarul de colonii formate/numarul de celule insamantate x 100

Mod de lucru:

Se insamanteaza celule la o densitate de 50 celule/cm² si se incubeaza la 37⁰ fara a se misca timp de 10 zile. Dupa 10 zile se scot placutele, se indeparteaza mediul si se coloreaza astfel:

-2 spalari cu PBS;

- fixare cu metanol absolut la +4⁰ C, timp de 5 minute;

- coloratie cu 10% Giemsa pentru 20 min.;

Dupa fiecare din ultimele 3 etape se realizeaza cate 3 spalari de1 min. cu apa distilata.

Uscare si numarare coloni la microscop cu obiectivul de 10x.