Subiecte laborator Biologie celulara, moleculara. Genetica

Partea mecanica a microscopului optic. Partea mecanica cuprinde:

• Talpa sau piciorul microscopului confectionata din metal, asigura stabilitate si rezistenta microscopului. In talpa microscopului se gaseste montata sursa de iluminare si diafragma cu ajutorul carora se regleaza cantitatea de lumina care este orientata spre preparatul microscopic.
• Manerul sau gatul microscopului este fixat de talpa microscopului si are rol in sustinerea unor parti componente ale microscopului. Manerul microscopului ajuta la manipularea acestuia.
• Masuta sau platina are rol in sustinerea preparatului microscopic cu ajutorul unor lame metalice numite cavaleri sau valeti. Una dintre lamele metalice este fixa, iar cealalta este mobila. Masuta are forma patratica si prezinta in zona centrala un orificiu elipsoidal prin care trec razele luminoase generate de sursa de lumina spre preparatul microscopic. Pe masuta se gasesc doua rigle care ajuta la stabilirea coordonatelor la care se gaseste preparatul. Sub masuta in partea dreapta se afla un car mobil format din doua suruburi suprapuse, unul superior si altul inferior care deplaseaza platina antero-posterior si latero-lateral, permitand aducerea preparatului in axul optic.
• Tubul microscopului este asezat in partea superioara a manerului. La acest nivel se afla revorverul constituit din doua calote metalice suprapuse una fixa si alta mobila care poarta obiectivele. Cu ajutorul revorverului sunt aduse in axul optic obiectivele dorite. In partea superioara a tubului se gasesc cele doua oculare.
• Dispozitivul de reglare a imaginii microscopice se afla asezat pe partile laterale ale manerului microscopului si este constituit din doua suruburi:
• Surubul (viza) macrometric deplaseaza tubul microscopic cu pas mare permitand prinderea imaginii de ansamblu a preparatului.
• Surubul (viza) micrometrica deplaseaza tubul microscopic cu pas mic permitand prinderea  clara a imaginii preparatului.

2. Partea optica a microscopului optic.

Partea optica a microscopului cuprinde obiectivele si ocularele.

Obiectivele microscopului sunt alcatuite dintr-un sistem de lentile. Lentila inferioara (frontala) are rol in formarea imaginii microscopice, iar celelalte lentile din alcatuirea obiectivului corecteaza greselile optice ale lentilei frontale. Fiecare obiectiv are puterea de marire gravata pe montura.

Obiectivele sunt de doua tipuri:

• obiective uscate numite astfel deoarece intre preparatul microscopic si lentila frontala se gaseste un strat de aer. Aceste obiective au urmatoarea putere de marire gravata pe suprafata lor:  4x, 10x, 20x, 40x.
• obiective umede (obiective cu imersie). La aceste obiective intre preparat si lentila frontala se aplica un lichid de imersie cum este uleiul de cedru sau uleiul de parafina. Lichidele de imersie utilizate in microscopie au indicele de refractie (n) apropiat sau similar cu cel al sticlei. In cazul obiectivelor cu imersie se elimina refractia, obtinandu-se o imagine microscopica clara si mai luminoasa. Obiectivele umede au puterea de marire 90x, 100x.

Grosismentul microscopului este produsul dintre puterea de marire a ocularelor si obiectivelor si reprezinta puterea de marire a microscopului.

Ocularele sunt montate in partea superioara a tubului microscopului, generand o imagine marita si virtuala. Un ocular este constituit din doua lentile plan-convexe, una superioara si una inferioara, orientate cu fata plana in sus. Lentila superioara are diametru mic si se numeste lentila ochiului, iar cea inferioara are diametru mare si se numeste lentila campului.

3. Sistemul de iluminare al microscopului optic.

Sistemul de iluminare este constituit din urmatoarele componente:

• bec de 6 V sau 12 V montat in talpa microscopuluiA
• oglina plana care transmite fasciculul luminos generat de bec prin orificiul din talpa microscopului spre condensator.
• Diafragma iris functioneaza precum pupila ochiului uman, cand diafragma este deschisa putin fasciculul luminos care lumineaza campul microscopic este redus, iar cand este deschisa la maxim campul microscopic este puternic iluminat.
• Condensatorul montat sub masuta focalizeaza fasciculul luminos prin orificiul elipsoidal spre preparatul microscopic. Acesta poate fi ridicat sau coborat cu ajutorul unui surub plasat pe manerul microscopului in partea dreapta.

4. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Fixarea materialului biologic.

Fixarea Fragmentele de tesuturi trebuie fixate imediat dupa recoltare, in recipiente care sa cuprinda piesa de fixat si lichidul fixator. Lichidul fixator trebuie sa acopere complet piesa anatomica. In acelasi recipient se va introduce o bucata de hartie pe care se scrie cu creion negru, numarul de inregistrare al piesei anatomice.

Pe fundul vasului se pune hartie de filtru, sau piesa se va suspenda printr-un fir de ata de dopul recipientului. Daca se fixeaza in acelasi timp mai multe piese anatomice, atunci ele se pun fiecare in bucati de tifon insotite de o bucatica de hartie pe care se noteaza tipul piesei anatomice si numele subiectului. Piesa introdusa in fixator trebuie sa vina in contact cu fixatorul pe toata suprafata sa.

Substantele fixatoare se folosesc singure sau in amestec. De exemplu: formolul pastreaza forma, culoarea si structura preparatelor, el este un bun fixator pentru studiul lipidelor si al sistemului nervos. Structurile nucleare, sangele, glicogenul, fierul si ureea sunt alterate de actiunea formolului. Dintre amestecurile fixatoare folosite sunt: lichidul Bouin-Hollande, lichidul Zenker, Carnoy, Champy.

Durata fixarii este in functie de compozitia fiecarui fixator. Mentinerea prelungita a pieselor in fixator, dupa terminarea fixarii poate determina alterari ale tesuturilor.

5. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Includerea in parafina- timpii de realizare.

Includerea in parafina: Aceasta etapa se realizeaza in 4 timpi:

• Deshidratarea
• Clarificarea
• Parafinarea
• Includerea piesei.

6. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Includerea in parafina- deshidratarea. Deshidratarea

Analiza: Slabim cu fructe uscate? - precautie si sfatul medicului Eseu: Martini - cocktail facut traditional din gin si vermut alb sec

Necesitatea acestei operatii deriva din neamestecarea apei cu parafina. Din acest motiv apa trebuie eliminata din tesuturi si inlocuita cu un alt lichid. Deshidratarea cu alcool etilic este cea mai utilizata metoda. In acest scop, piesa biologica se trece in solutii de alcool cu concentratii crescande: 80⁰, 90⁰, 96⁰ si de 2 - 3 ori in alcool absolut. Durata mentinerii in aceste dilutii este in functie de marimea si calitatea piesei. De obicei, 2 minute pentru fiecare baie.

7. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Includerea in parafina- clarificarea. Clarificarea

Deoarece alcoolul nu este miscibil cu parafina, el trebuie scos din piese si inlocuit cu un lichid miscibil cu parafina, ca de exemplu: xilen, toluen, benzen. Este preferat toluenul deoarece nu intareste piesa si este mai volatil. La trecerea prin cele 3 bai de toluen piesele se zvanta pe hartie de filtru.

8. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Includerea in parafina- parafinarea. Parafinarea

Aceasta operatie consta in punerea pieselor biologice la termostat, la 56^oC in trei bai de parafina.

In prealabil, parafina se omogenizeaza la 70⁰C si pentru a fi mai elastica se adauga ceara de albine in proportie de 5 - 10 %. Amestecul va fi filtrat, racit si tinut la termostat.

Durata mentinerii pieselor in amestecul cu parafina variaza in functie de marimea si densitatea pieselor, fiind intre 1 - 6 ore. Mentinerea indelungata a pieselor in acest amestec trebuie evitata pentru ca ele devin dure si greu de sectionat.

Deoarece parafina se impurifica dupa un anumit timp prin amestecarea cu substantele volatile din piese, se recomanda inlocuirea ei la anumite intervale, in functie de intensitatea folosirii ei.

9. Metode uzuale pentru examinarea celulelor la microscopul optic. Includerea in parafina Includerea in parafina

Dupa ce piesele au fost tinute in cele trei bai de parafina, ele se monteaza in blocuri de parafina.

Pentru formarea acestor blocuri, in mod curent sunt folosite barele Leuckart. Barele prezinta cele doua laturi de 2 cm latime si se aseaza in unghi drept. Pentru turnarea blocurilor, barele unse cu glicerina se aseaza pe o placa metalica sau de sticla cu suprafata perfect slefuita. Piesa biologica va avea fata care trebuie sectionata in jos, spre placa de sticla.

Forma fiind definitivata turnam in ea parafina topita pana la nivelul superior al barelor. Cu o pensa incalzita, se scoate piesa din ultima baie de parafina si o cufundam in parafina din forma. Piesa va fi intotdeauna scoasa din baia de parafina calda. Nu se monteaza piesa rece. Forma cu parafina in care s-a inclus piesa, se lasa sa se raceasca la temperatura camerei sau se scufunda intr-un vas cu apa rece.

Blocul de parafina obtinut va fi fasonat, indepartand surplusul de parafina, astfel incat sa ramana in jurul piesei 1 - 2 mm de parafina. Se noteaza pe bloc, datele in legatura cu piesa biologica (numarul, data). Blocurile pot fi tinute in plicuri sau in cutii de carton, la r

10. Frotiul - preparat biologic; definitie, scop.

FROTIUL - preparat biologic

Definitie: este o metoda prin care se realizeaza intinderea celulelor in monostrat pe lame port-obiect.

Scopul: utilizata ca procedeu de diagnostic patologic.

Sub forma de frotiu pot fi examinate :

- celulele sangvine (periferice si medulare);

- celulele epiteliale descuamate sau exfoliate (din piele, cavitate bucala, faringe, cai extra si intrapulmonare, vagin, col uterin, endometru, canale galactofore, prostata, uretra etc.);

- sedimente celulare (din urina, suc gastric, bila, lichid cefalorahidian, lichid pleural, ascita);

- amprente din diferite tesuturi sau organe parenchimatoase.

11. Tehnica obtinerii unui frotiu.

Tehnica obtinerii unui frotiu

Se folosesc 2 lame de sticla:

- lama port-obiect, cu margini slefuite, curata, degresata si uscata;

- lama executoare - o lama cu 2 colturi rupte.

Pe masa de lucru se aseaza lama port-obiect. La unul din capetele lamei port-obiect se aplica o picatura de 2 mm de material biologic. Lama executoare se pune in fata picaturii in unghi de 45⁰ cu lama port-obiect. Cu ajutorul lamei executoare se realizeaza o miscare de inaintare continua si rectilinie, pentru ca frotiul sa nu iasa ondulat sau discontinuu. Pentru obtinerea unui frotiu de calitate, picatura trebuie sa nu fie prea mica pentru ca frotiul obtinut va fi mic si cu elemente celulare insuficiente pentru o examinare corecta, dar nici prea mare pentru ca frotiul obtinut va fi prea gros.

Cand materialul de examinat este prea dur (celule epidermice descuamate), sau prea vascos (sputa), el poate fi dispersat intre cele doua lame prin miscarile de glisare.

- Amprenta se realizeaza printr-un simplu contact intre fragmentul de tesut si lama port-obiect.

12. Calitatile unui frotiu bun.

Calitatile unui frotiu bun:

- trebuie sa fie subtire, cu celulele dispersate intr-un singur strat;

- sa prezinte ambele margini pe lama port-obiect;

- portiunea terminala sa fie mai ingusta, rotunjita si sa prezinte franjuri;

- sa fie intins uniform, fara ingrosari, striatii sau intreruperi;

-la unul din capetele lamei port-obiect se noteaza date de identificare a preparatului.

13. Colorarea unui frotiu.

Colorarea frotiului:

Se usuca frotiul la temperatura camerei.

Se acopera suprafata frotiului prin pipetare cu fixator May - Grumwald si se lasa timp de 2 minute.

Se adauga peste fixator apa distilata 2 minute.

Se inlatura amestecul fixator - apa distilata.

Se pipeteaza pe suprafata frotiului solutie Giemsa 10%, timpul optim de colorare este de 25 minute.

Se spala frotiul sub jet de apa.

Se usuca si se observa la microscopul optic cu obiectivele 10x, 20x si 40x. Daca se utilizeaza obiectivul de imersie, nu este necesara aplicarea lamelei, intrucat uleiul de imersie nu afecteaza celulele din frotiu.

Se recomanda ca vizualizarea sa se faca pe marginea frotiului deoarece in aceasta zona celulele sunt dispersate intr-un singur strat, iar leucocitele nu au morfologia afectata.

In frotiul obtinut se vor evidentia eritrocitele de culoare cenusie cu nuante rosii-albastrui si diferite tipuri de leucocite, bine evidentiate, cu nucleul colorat in rosu.

14. Tehnici de fractionare celulara: aplicatii practice.

Tehnici de fractionare celulara. Aplicatii practice:

Izolarea membranelor eritrocitare.

Izolarea nucleilor hepatici prin centrifugare diferentiala.

Izolarea mitocondriilor, lizozomilor si peroxizomilor prin centrifugare in gradient de densitate.

Organitele celulare desi pot fi observate cu ajutorul microscopului, studiul detaliat al structurii si functiilor lor metabolice poate fi realizat doar in conditiile izolarii lor in cantitati relative mari. Izolarea organitelor celulare se face prin tehnicile de fractionare celulara.

O fractiune celulara cuprinde o populatie omogena de particule celulare care se izoleaza in aceleasi conditii. Pentru aceasta celulele dintr-un tesut sunt sparte prin mijloace fizice, obtinandu-se un omogenat celular, care contine toate fractiunile in suspensie. Prin diferite tehnici de centrifugare, fractiunile se pot izola si purifica separat, pe baza vitezei lor de sedimentare sau in functie de densitatea lor.

15. Izolarea nucleilor hepatici prin cetrifugare diferentiata. Evidentierea nucleilor la microscop.

Izolarea nucleilor hepatici prin centrifugare diferentiata

Evidentierea nucleilor la microscop

Sedimentul de nuclei se fixeaza prin suspendare in alcool metilic absolut, timp de 15 minute.

Pe o lama port-obiect se pune p picatura de suspensie nucleara si se intinde un frotiu.

Dupa uscare frotiul se coloreaza cu solutie Giemsa 10 % si se examineaza la microscop.

16. Izolarea mitocondriilor, peroxizomilor si lizozomilor; rezultate.

Izolarea mitocondriilor, peroxizomilor si lizozomilor prin centrifugare in gradient de densitate

Rezultate:

Cele 3 fractii se dispun in gradient in zonele de densitate corespunzatoare lor. Astfel, la fundul eprubetei sedimenteaza lizozomii, peroxizomii formeaza banda mijlocie dispunandu-se la densitatea 1,28, iar la suprafata, in zona de densitate de 1,23 se dispun mitocondriile. Organitele celulare se aspira cu o seringa si se pun in vase separate. Se dilueaza cu solutie Tris-HCl 0,01M, pH 7,2, pana la o concentratie de sucroza de 0,25 M. Se aduna din nou in sediment prin centrifugare la 17000 g timp de 10 minute si se suspenda in final in volume adecvate de solutie tampon Tris-HCl 0,01 M, pH 7,2.

Pentru a realiza caracterizarea lor chimica sau enzimatica, fractiunile celulare se solubilizeaza cu un detergent (Triton X100) sau prin soc osmotic. Pentru fractia mitocondriala se poate utiliza drept criteriu biochimic de puritate evidentierea activitatii enzimei succinat-dehidrogenaza. Pentru fractia lizozomala se foloseste fosfataza acida, iar pentru peroxizomi catalaza.