Generarea cardiomiocitelor din celulele stem embrionare

Generarea cardiomiocitelor din celulele stem embrionare

Insuficienta cardiaca reprezinta pe plan mondial, una din afectiunile cele mai frecvente intalnite la oameni. In dorinta de a rezolva aceasta afectiune, cercetatorii au pornit de la premiza ca ar fi celulele ideale pentru cardiomioplastie.

Derivate din linii celulare stem embrionare, acestea prezinta avantajul dat de posibilitatea de a se reproduce perioade lungi de timp fara diferentiere. Pentru obtinerea cardiomiocitelor au fost utilizate diferite tipuri de linii celulare.

In cadrul experimentelor in care materialul biologic este reprezentat de soareci, celulele obtinute de la aceste animale, prezinta expresia unor proteine cardiace specifice si formeaza grefe cand sunt injectate direct la soarecii cu infarct miocardic indus experimental. Celulele cardiace prezinta activitate contractila spontana si sincrona cu celulele adiacente, grefa ramanand stabila mai multe saptamani dupa implantare (Hescheler J.M., 2004).

In prezent semnalam cresterea numarului tehnicilor de evaluare a proprietatilor fundamentale a celulelor stem embrionare si posibilitatea lor de diferentiere. In ceea ce priveste corpusculii embrionari, acestia nastere la celule derivate din cele trei straturi embrionare incluzand si cardiomiocitele (Robert L., si col 2004).

Diferentierea celulelor stem embrionare permite studierea in vitro a tuturor stadiilor consecvente ale potentialului activ de dezvoltare in timpul cardiomiogenezei mamiferelor (Kenneth R.B., si col., 2002).

Obtinerea de cardiomiocite "in vitro"

Diferentierea in vitro a celulelor stem embrionare necesita ca prim pas, o agregare initiala pentru a forma structuri si corpuri embrionare definite. Acest fenomen le confera posibilitatea diferentierii intr-o varietate de tipuri celulare specializate, inclusiv cardiomiocite. Potentialul de diferentiere a celulelor stem embrionare murine in cardiomiocite este definit de o serie de parametrii:

numarul de celule din corpusculii embrionari;

mediul, cantitatea si calitatea serului fetal (FCS), factorii de crestere si aditivii (factorii de cumulare) utilizati pentru inducerea diferentierii;

linia celulara utilizata;

timpul necesar formarii agregatelor celulare.

In cadrul dezvoltarii corpusculiilor embrionari, cardiomiocitele sunt localizate intre stratul epitelial si cel bazal al celulelor mezenchimale. Cardiomiocitele se pot identifica usor, deoarece incepand din ziua 4-5 de diferentiere se contracta spontan. Odata cu inaintarea in timp, numarul batailor spontane creste, tot corpusculul continand celule contractile localizate. Rata contractiei in fiecare arie de bataie creste rapid odata cu diferentierea, fenomen urmat de o descrestere si apoi de maturizare. In functie de numarul celulelor din etapa initiala de agregare, se produc schimbari in rata batailor, contractiile spontane continuand de la cateva zile la o luna. Dupa diferentierea completa adesea contractiile se opresc, desi celulele pot fi mentinute in cultura timp de mai multe saptamani (Around C.F. si col. 2003).

Modificarile de dezvoltare ale cardiomiocitelor pot fi corelate cu lungimea timpului in cultura, putand da nastere la cele 3 stadii de diferentiere:

timpurii (pacemaker - like sau cardiomiocite primare)

intermediare si tirzii (artial, ventricular, nodal, His, si celulele Purkinge).

In timpul etapelor de diferentiere timpurii, cardiomiocitele din corpusculii embrionari sunt tipic mici si rotunde. Miofibrilele nou formate sunt imprastiate, organizate neregulat, unele continand fascicule paralele de miofibrile ceea ce dovedeste prezenta bandelor A si I. Cardiomiocitele apropiate indica adesea diferite grade de organizare a miofibrilelor (Kenneth R.B. si col., 2002). Odata cu maturarea, cardiomiocitele provenite din celule stem embrionare devin alungite cu miofibrile bine dezvoltate si sarcomere. Celulele contractile sunt mononucleate, de forma bacilara si au jonctiuni intracelulare solide ca cele observate la cardiomiocitele dezvoltate in cord. In timpul etapelor de diferentiere terminale, pot fi observate fasciculele bine organizate de miofibrile dens imbinate si se pot observa si sarcomerele avand benzile A,I si discurile Z clar definite. Diametrul, aria, ultrastructura si arhitectura miofibrilelor provenite din celulele stem embrionare cat si lungimea sarcomerelor sunt similare cu cele ale miocitelor neonatale ale rozatoarelor. Cardiomiocitele derivate din celulele stem embrionare exprima gene cardiace intr-o maniera controlata de dezvoltare (Wobus A., si col 2005, Robert R., 2006). In dezvoltarea timpurie a miocardului, ARN codificand factorii de transcriptie limitati GATA- 4 si Nkx2,5, acestia apar in corpusculii embrionari inainte ca ARN- ul sa codifice factorul atrial natriuretic (ANF), lantul de miozina luminos (MLC) -2v, α-miozina intunecata (α- MHC), β miozina lantul intunecat, schimbul Na+- Ca2+ si fosfolambanul.

Proteinele sarcomerice ale cardiomiocitelor provenite din celulele stem embrionare, au de asemenea stabilita dezvoltarea in urmatoarea ordine: titin (z disck), α- actina, miozina, M proteina. Cardiomiocitele cu proprietati similare cu ale celor neonatale de la rozatoare au izoforme troponina I musculara scheletala scazuta si o proportie mare de β -MHC, in plus cardiomiocitele care se contracta mai rapid, de preferinta exprima troponina cardiaca I si lantul de miozina intunecata α-MHC. Astfel, aparita produselor genetice asociate cardiace sunt asigurate de diferentierea in timp, fapt similar cu cel observat in cazul dezvoltarii miocardului normal (Kenneth R.B. si col., 2002).

Cardiomiocitele timpurii provenite din celulele stem embrionare au propietati electrofiziologice tipice celor  intalnite in cazul cardiomiocitelor postnatale. Celulele diferentiate au caracteristicile farmacologice si fiziologice specifice ale celulelor miocardice specializate, inclusiv celule atriale, ventriculare, Purkinje si pacemaker. In plus tubulii T nu sunt proeminenti (Wobus A., si col 2005, Gocza E., si col. 2008).

Din punct de vedere functional, aceste cardiomiocite au sensibilitate contractila normala la calciu si arata multe forme de excitatie - contractie, similar cardiomiocitelor fetale si nonfetale. Cardiomiocitele provenite din celulele stem embrionare sunt responsabile de stimularea β -adrenergica. Celulele embrionare germinale sau corpusculii embrionari de soarece manifesta o capacitate ridicata de a forma cardiomiocite in vitro.

Dupa inductia cu dimetilsufoxid, celulele stem embrionare, contin un procent mare de cardiomiocite. Aceste cardiomiocite se contracta spontan, au caracteristici tipice similare celor diferentiate tarziu si contin copii care sunt exprimate temporal. Diferentierea rapida in vitro a celulelor stem embrionare in cardiomiocite, impreuna cu analizele de contractie si cu cele electrofiziologice, ofera cercetatorilor un model valoros pentru studierea proceselor de dezvoltare cardiaca (Around C.F. si col. 2003).