Dozarea hemoglobinei

Dozarea hemoglobinei

Evaluarea cantitativa a hemoglobinei din sange se poate face prin metode colorimetrice sau chimice.

Metoda colorimetrica Sahli

Principiul metodei este compararea clorheminei obtinute in sangele de cercetat cu solutia de clorhemina standard a hemometrului.

Material necesar:

hemometru Sahli

solutie HCl N/10

apa distilata

Hemometrul este alcatuit dintr-un stativ cu 3 eprubete:

2 eprubete laterale continand substanta etalon (sau doua baghete de sticla de

aceeasi culoare)

o eprubeta centrala ce serveste pentru determinare si este gradata de jos in sus de la 10 la 140% sau unitati hemometrice (UH).

Diviziunea 100 corespunde, conform etalonarii, cu 16%. Deseori eprubeta

prezinta si o a doua scara de diviziune in grame Hb%.

Aparatului ii sunt anexate: o pipeta capilara pentru recoltarea sangelui, avand un singur reper la 20 mm³, o pipeta pentru apa distilata si o bagheta de sticla pentru omogenizare.

Tehnica de lucru:

Se introduce in eprubeta de dozare a aparatului HCl N/10 pana la diviziunea 10 UH. Se dezinfecteaza pulpa degetului si se inteapa cu acul. Se sterge prima picatura si din a doua picatura de sange aparuta se aspira cu pipeta capilara 20 mm³. Se introduce pipeta in tubul de cercetat si se lasa sa cada sangele. Se aspira de 2-3 ori din solutia de HCl pentru a spala urmele de hemoglobina de pe peretii pipetei. Se agita cu bagheta de sticla si se asteapta 5 minute pentru transformarea hemoglobinei in clorhidrat de hematina de culoare brun-inchis. Se adauga apa distilata picatura cu picatura si se omogenizeaza cu bagheta de sticla, pana ce in tubul de cercetat se obtine o nuanta egala cu cea a etalonului. Se citeste cifra corespunzatoare meniscului inferior al lichidului din tub.

Ea reprezinta direct cantitatea de hemoglobina din sangele respectiv exprimata in unitati Sahli - procentual. Pentru cazurile in care eprubeta nu are a doua scara de diviziune in g%, calculul se face in felul urmator:

daca diviziunea 100 corespunde, conform etalonarii, cu 16 g%, atunci cifra gasita de determinare va corespunde:

100.16g/dl

85.x

x = 85x16 = 13,6 g/dl sange

100

Valori normale:

barbat adult = 15,1 +/- 2 g/dl (75-100%)

femeie adulta = 13,1 +/- 2 g/dl (70-90%)

In general, variatiile fiziologice si patologice ale hemoglobinei urmeaza sensul de

variatie a numarului de eritrocite.

Metoda colorimetrica dupa principiul Sahli se utilizeaza in mod curent in clinica, fiind cea mai expeditiva. Pentru cercetare se pot folosi metode ca: fotometria in trepte sau spectofotometria bazata pe masurarea extinctiei unei solutii comparativ cu cea a etalonului.

Numaratoarea eritrocitelor

Principiu: Se numara direct la microscop eritrocitele dintr-un volum de sange cunoscut, diluat intr-o proportie cunoscuta.

Dilutia sangelui este necesara pentru a numara eritrocitele care sunt foarte numeroase si pentru ca sangele sa nu coaguleze.

Material necesar:

lichid de dilutie

pipeta pentru eritrocite

camera de numarat

microscop

ace, alcool, vata, eter

Lichidul de dilutie:

Lichidul Hayem:

o      Clorura de sodiu 1 g

o      Sulfat de sodiu 5 g

o      Sublimat 0,5 g

o      Apa distilata 200 ml

- sau ser fiziologic

Pipeta pentru dilutia eritrocitelor (pipeta Potain) prezinta un tub capilar si o bula de dilutie cu o perla mobila, de culoare rosie. Tubul capilar este gradat, fiind notate diviziunile 0,5 si 1, iar spatiul dintre ele este divizat in 10 segmente egale. Deasupra liniei de dilutie este notatia 101. Daca sangele este recoltat in tubul capilar pana la diviziunile 0,5 sau 1 si apoi completat cu lichidul de dilutie pana la notatia 101, se obtine o dilutie a sangelui de 1/200 sau respectiv 1/100. Partea de sus a pipetei se adapteaza la un tub de cauciuc care permite o aspiratie uniforma. Capacitatea totala a pipetei este de 101 volume, dar dilutia este de 1/100 si 1/200 deoarece un volum de diluant ramane in tubul capilar si nu dilueaza sangele.

Camera de numarat este o lama groasa de sticla in mijlocul careia se gasesc gravate una sau doua retele de patrate cu dimensiuni cunoscute: patrate mari, cu latura de 1/5 mm, deci suprafata de 1/25 mm² si patrate mici cu latura de 1/20 mm, deci suprafata egala cu 1/400 mm². Intre suprafata retelei de patrate si lamela care se fixeaza pe aceasta se gaseste un spatiu de 1/10 mm.

Se cunosc mai multe tipuri de camere de numarat, insa toate construite dupa acelasi principiu, deosebirea dintre ele fiind numai numarul de patrate si felul de asezare al acestora.

Camera Burker - Turk are o suprafata de 9 mm² si reteaua este gravata dupa tipul Turk, combinat cu tipul Thoma. Suprafata de 9 mm² este marginita pe toate laturile de o tripla linie si este impartita in 9 patratele de 1 mm² prin linii triple. Patratul din mijloc, de 1 mm2 este de tip Thoma care se foloseste pentru numaratoarea eritrocitelor. Patratele inferioare si superioare drepte si stangi sunt impartite in 16 patratele separate intre ele prin linii duble.Un astfel de patratel are o suprafata de 1/25  dintr-un mm², adica o suprafata egala cu 16 patratele mici de 1/400 mm². Aceste suprafete se folosesc pentru numaratoarea globulelor albe.

Tehnica de numarare. Dupa inteparea pulpei degetului, prima picatura se sterge, iar a doua se aspira in pipeta pana la diviziunea 0,5 sau 1, evitandu-se patrunderea bulelor de aer. Daca sangele depaseste usor diviziunea, prin atingerea varfului pipetei cu o hartie de filtru, coloana de sange se poate potrivi exact pana la diviziunea dorita. Se aspira apoi lichid de dilutie pana la diviziunea 101. Se fixeaza pipeta intre police si indice si se agita viguros pentru omogenizare. Pana la numaratoare pipeta ramane in pozitie orizontala.

Umplerea camerei de numarat. Se aplica lamela pe lama camerei de numarat. Se agita din nou pipeta timp de 2-3 minute, apoi primele 2-3 picaturi se arunca, pentru a indeparta lichidul din capilar care nu a fost supus omogenizarii. Picatura urmatoare se aduce la marginea lamelei, aceasta patrunde intre lama si lamela. Se urmareste ca spatiul dintre lama si lamela sa fie umplut in totalitate, fara ca lichidul sa treaca in santurile laterale, fara ca lamela sa se deplaseze, fara sa intre bule de aer in camera. In caz contrar, operatia de umplere se repeta, dupa stergerea camerei. Se aseaza camera de numarat pe platina microscopului, se asteapta 3 minute, timp necesar sedimentarii eritrocitelor. Se foloseste obiectivul 40, ocular 7-10 si iluminare slaba.

Numaratoarea eritrocitelor. Se examineaza camera la microscop si se numara elementele ce se gasesc pe cadrilaj in patratelele mici de 1/400 mm². Se numara, de exemplu, 5 patrate mijlocii de dimensiunea 1/25, continand fiecare cate 16 patratele de 1/400, deci in total 80 de patratele mici de 1/400 mm². Alegerea patratelor mijlocii se face pe sarite, pentru a evita eroarea data de distributia inegala a eritrocitelor pe suprafata camerei. Pentru a nu numara de doua ori acelasi eritrocit, elementele situate pe laturile de delimitare se numara numai pe doua laturi, de exemplu sus si stanga.

Calcul

Nr hematii/mm3 = N x 5 x I x D, in care:

N = numarul de hematii numarate pe 80 de patratele.

Cifra 5 reprezinta corectia pentru suprafata de 1 mm² (80 de patratele reprezinta totalul de 400 de patratele de pe 1 mm²)

I = corectia pentru inaltimea camerei (pentru a raporta pe mm³)

D = corectia pentru dilutie

Daca dilutia este de 1/200, inaltimea fiind de 1/10, se va inmulti cu 200 si respectiv 10.

De exemplu, daca in 80 de patratele mici gasim 500 de eritrocite,

Nr. hematii/mm³ = 500x5x200x10 = 5 000 000

Cand dilutia este de 1/100 si in 80 patratele mici numaram 900 eritrocite:

Nr hematii/mm³ = 900 x 5 x 100 x 10 = 4 500 000

In Sistemul International al unitatilor de masura, unitatea de volum este litrul: 1 milion de eritrocite/mm³ = 1 x 10¹² eritrocite/l.

Cauze de eroare:

diluarea sangelui prin comprimarea degetului

pipetarea sau diluarea incorecta a sangelui

Referat: Clasificarea alimentelor permise pentru mentinerea echilibrului ponderal Document online: Trebuie inlocuit zaharul copiilor cu indulcitori?

patrunderea de aer in pipeta Potain

omogenizare insuficienta

examinarea unui numar mic de patrate.

Erorile admise intre doua numaratori facute din acelasi sange sunt de 100 000-200 000 hematii/mm³.

Valori normale:

Valori crescute ale numarului de eritrocite se constata la altitudine - poliglobulia de altitudine - dupa activitati fizice sustinute, in poliglobulii primitive sau secundare.

Scaderea numarului de eritrocite se intalneste in anemii.

Variatii marcate se intalnesc in raport cu starile de deshidratare sau hemoconcentratie care deseori mascheaza situatiile reale.

Numaratoarea eritrocitelor - vedere la microscop

LEUCOCITELE

Valori normale:

Valori crescute reprezinta leucocitoze, iar cele scazute se numesc leucopenii.

Leucocitozele fiziologice se constata la cateva minute dupa un efort fizic, un pranz bogat, o emotie sau la copii dupa plans, in cursul ultimului trimestru de sarcina, dupa un zbor cu avionul sau o excursie la altitudine de peste 1 000 m, numarul de leucocite ajungand la 10 000-14 000/mm³.

Leucopenii fiziologice se constata la batrani si surmenati fizic.

Variatii patologice:

Leucocitoza - valori pana la 20 000 - 30 000/mm³  in infectii acute, pana la 60 000/mm³ in reactii leucemoide, intre 100 000-300 000/mm³ in diferite tipuri de leucemie.

Leucopenie in: casexie, inanitie, debilitate fizica, febra tifoida, agranulocitoza, dupa tratamente cu raze Roentgen sau cu diferite medicamente ca amidopirin, antitiroidiene, anticonvulsivante, sulfamide sau determinata de agenti toxici (benzen).

FORMULA LEUCOCITARA

Seria leucocitara denumita si seria alba cuprinde trei linii celulare distincte:

granulocitara

limfocitara

monocitara

Seria granulocitara cuprinde granulocite neutrofile, eozinofile si bazofile din sange si tesuturi, precum si precursuorii lor din maduva osoasa hematogena.

Granulocitul nesegmentat

Caracteristice pentru acest stadiu de evolutie sunt condensarea cromatinei

nucleare si forma de banda a nucleului, realizand aspecte de potcoava sau litera S. Citoplasma este acidofila si contine granulatii diferentiate: neutrofile, eozinofile sau bazofile.

Granulocitul segmentat.

Aceste celule, denumite impropriu polimorfonucleare, au nucleul polilobulat. Cu cat celula este mai matura, cu atat are mai multe segmente, in mod normal pana la 5. Ca dimensiuni variaza intre 10-15 um.

a.     Granulocitul segmentat neutrofil - are citoplasma acidofila, roz-palid, cu granulatii neutrofile, nucleul are doua sau mai multe segmente.

b.     Granulocitul segmentat eozinofil are citoplasma plina cu granulatiile caracteristice portocalii. Nucleul prezinta numai doua segmente.

c.      Granulocitul segmentat bazofil se recunoaste prin prezenta granulatiilor caracteristice, care acopera toata citoplasma, multe suprapuse peste nucleu. Nucleul este segmentat, deseori neregulat.

In sangele periferic se intalnesc granulocite segmentate si un numar mic de

nesegmentate, care nu depasesc 4% din totalul granulocitelor periferice.

Seria limfocitara. Limfocitele au dimensiuni si caracteristici morfologice, in functie de gradul lor de maturitate.

Limfocitul mare - 10-16 um, nucleul este mare, rotund sau ovalar, inchis la

culoare, fara nucleol, inconjurat din toate partile de citoplasma bazofila.

Limfocitul mic este o celula de talie mica, 6,2-9 um. Nucleul usor ovalar, cu

cromatina foarte densa, violet inchis, ocupa aproape toata suprafata celulei, citoplasma intens bazofila fiind redusa la o dunga foarte vizibila numai pe o parte din circumferinta nucleului.

3. Seria monocitara. Monocitul este forma matura a seriei, care se gaseste in mod normal in sangele periferic. Are diametrul de 20-25 um, cu nucleu polimorf, forma ovala sau cea reniforma fiind cel mai des intalnita, sarac in cromatina, palid. Nu prezinta nucleoli. Citoplasma are culoarea albastra-cenusie, palida, cu fine granulatii azurofile.

Formula leucocitara

Reprezinta raportul procentual al leucocitelor pe frotiul sangelui periferic, dupa numararea a cel putin 200 elemente.

Tehnica

Se studiaza pe frotiu sanguin colorat May-Grumvald-Giemsa. Se pune o picatura de oleu de cedru pe lama si se pune la punct microscopul, folosind obiectivul cu imersie, diafragmul deschis, condensatorul sus. Lama va fi deplasata in asa fel incat marginea frotiului sa fie deplasata in zig-zag. Pe masura ce se intalnesc leucocitele, se noteaza pe un tabel in dreptul simbolului, notatia facandu-se pe grupe de cate 5. Se numara in total 200 de elemente si se face procentajul fiecarei clase.

Raportul procentual al diferitelor tipuri de leucocite reprezinta o apreciere cantitativa indirecta, foarte relativa. De aceea trebuie sa se cunoasca valoarea absoluta a fiecarui tip celular, care se obtine cunoscand procentul tipului celular respectiv si numarul leucocitelor/mm³.

Exemplu: pentru un numar de leucocite de 6200-mm³, formula arata 70% neutrofile segmentate. Atunci:

x..70

x = 6200 x 70 = 4340/mm³

100

Valori relative si absolute, normale, ale diverselor tipuri de leucocite la adult:

Valorile formulei leucocitare si ale numarului de leucocite in functie de varsta:

La copiii mici predomina in formula limfocitele fata de neutrofilele segmentare, valorile lor se egaleaza in jurul varstei de 5-6 ani, apoi se inverseaza, ajungand treptat la valorile adultului.

Variatiile relative si absolute ale diferitelor tipuri de leucocite:
Neutrofilia - reprezinta cresterea numarului de neutrofile peste limitele normale. In aceasta situatie prezinta interes atat cifra absoluta a granulocitelor neutrofile/mm³ , cat si gradul de segmentare al nucleului. Prezenta elementelor neutrofile tinere in sangele periferic este considerata ca o dovada fie a unei activitati medulare intense, fie a unei citolize crescute.

Cresterea numarului de granulocite neutrofile:

Stari fiziologice: eforturi fizice mari, graviditate

Factori fizici: frig, caldura, dureri, traumatisme, arsuri

Factori psihici: teama, exaltare, furie

Infectii acute cu: coci, bacili, fungi, spirochete sau paraziti

Inflamatii: reumatismul poliarticular acut

Intoxicatii endogene (uremie, acidoza) sau exogene (plumb, mercur)

Stari posthemoragice postoperatorii, posthemolitice acute

Boli neinflamatorii ca tromboza coronariana

Boli neoplazice evolutive cu iritarea maduvei hematogene

Sindroame mielo-proliferative ca leucemia mieloida cronica - LMC

Neutropenia - scaderea neutrofilelor sub 2500/mm³. In general, majoritatea

leucopeniilor se datoreaza neutropeniei. Neutropeniile mai frecvent intalnite sunt in:

• Infectii grave generalizate
• Tulburari ale hematopoiezei, ca in anemia pernicioasa
• Dupa tratament cu raze Roentgen sau cu diferite medicamente ca amidopirin, antitiroidiene, anticonvulsivante, sulfamide
• Agenti toxici: Benzen
• Soc anafilactic
• Casexie, inanitie, debilitate fizica

Eozinofilia - cresterea numarului de granulocite eozinofile peste 350/mm³ in:

• Boli alergice (astm bronsic, edem Quincke)
• Parazitoze
• Dermatologice
• Tumori maligne
• LMC, leucoza cu eozinofilie, agranulocitoza

Eozinopenia - scaderea numarului de eozinofile sub 200/mm³

• Stari emotive puternice
• Stari de stres posttraumatic
• Infectii acute cu neutrofile
• Administrarea de hormoni corticoizi, ACTH, insulina

Cresterea numarului de granulocite bazofile:

sindroame mieloproliferative - LMC

anemii hemolitice si feriprive

inflamatii cronice

boli contagioase - varicela, variola

Disparitia bazofilelor:

in sarcina

boli alergice

tratament cu citostatice sau doze mari de raze Roentgen

Limfocitoza - cresterea numarului de limfocite peste limitele normale:

limfocitoza fiziologica la copil

tuse convulsiva, rubeola, tuberculoza, convalescenta in boli infectioase

LLC - leucemie limfatica cronica

Falsa limfocitoza - in cazuri de granulocitopenie

Mononucleoza infectioasa (limfo-monocite)

Limfopenia - scaderea numarului de limfocite sub 1000/mm³:

limfopoeza insuficienta - cauzata de atrofia primara sau secundara a sistemului limfopoetic

piierderi sau consum exagerat de elemente limfatice circulante - plasmoragie, limforagie

febra tifoida grava, tifos exantematic

Monocitoza - cresterea numarului de monocite peste 500/mm³:

mononucleoza infectioasa

infectii bacteriene ca: endocardita bacteriana, tuberculoza, bruceloza, febra tifoida ca si bolile reumatismale sau unele ricketsioze (tifos exantematic)

viroze ca: rujeola, hepatita epidemica, gripa

convalescenta bolilor infectioase si a celor virotice