Tehnica obtinerii formelor mutante - plante

Tehnica obtinerii formelor mutante - se utilizeaza 2 categorii de agenti mutageni si anume agenti mutageni fizici si agenti mutageni chimici.

In categoria agentilor mutageni fizici intalnim radiatiile, variatiile de temperatura, ultracentrifugarea.

Radiatiile sunt: ionizante si neionizante, sunt cu uniformitate mai mare radiatiile ionizante atat cele electromagnetice cat si cele corpusculare care in functie de doza afecteaza ereditar planta respectiva.

Se considera ca o doza corespunzatoare de iradiere ar fi cea care opreste cresterea si care provoaca moartea a 50% din material, aceasta doza poarta numele de DL50, reprezinta cantitatea de radiatii care provoaca moartea a 50% din material.

De regula se folosesc asa numitele doze critice, acestea sunt un pic mai mari decat cele mentionate anterior astfel ca in urma actiunii acestora supravietuiesc 30-40% din plante.

Cateva date in legatura cu aceste doze critice exprimate in kilograme: tomate - doza critica 20, castraveti 50, seminte de varza 80-100, morcov 80, ceapa bulbi 5-12, fasole boabe 8-12, gulie 35, ridichi de luna seminte 100-200, vita de vie seminte 10, vita de vie coarde 7-8, mar 5-7 la mugurii dorminzi, par 1,5-5, visin 0,5-3, prunul 2-5, laleaua 0,6, gladiola 15, garoafele 15-20 la seminte.

Variatiile de temperatura produc mutatii daca actioneaza asupra zigotului in primele sale faze de dezvoltare si aceste socuri constau in expunerea plantelor timp de 24 de ore la temperatura de 40-45⁰C.

Ultracentrifugarea are efect atunci cand actioneaza asupra celulelor in diviziune impiedicand migrarea cromozomilor spre polii celulei.

Agentii mutageni chimici sunt reprezentati de acele substante care actioneaza asupra acizilor nucleici in stare de repaos sau in timpul repicarii acestora.

Intre substantele mutagene a caror actiune este cunoscuta, exemplificam: azoserina, cofeina, timidina, formaldehida, fenolul, etilmetansulfuratul, dietilsulfatul, hidroxilamina, nitrozoetilureea, nitrozometilureea.

Introducerea agentilor chimici ca factori mutageni prezinta unele avantaje printre care:

efectele tratamentului nu necesita instalatii speciale care sa prezinte pericol de iradiere

interactiunea intre mutagen si substanta ereditara este mult mai eficienta fara sa se ajunga la restructurari cromozomice care conduc la moartea plantei;

frecventa mutatiilor utile este mult mai mare decat in cazul radiatiilor la fel si frecventa exemplarelor care supravietuiesc.

Indiferent de agentul mutagen utilizat, pentru a se reusi un numar mare de mutatii trebuie sa se respecte regulile: tratarea unui numar cat mai mare de plante sau organe ale acestora, utilizarea mai multor agenti mutageni care pot produce mutatii diferite, utilizarea unei plaje largi de doze in cadrul fiecarui agent mutagen, repetarea tratamentului mai multe generatii mutante.

Selectia formelor mutante perioada intre actiunea agentului mutagen si manifestarea fenotipica a mutatiei poarta numele de lag mutational, aceasta perioada depinde de natura mutatiei, de locul unde se manifesta, de faptul daca actioneaza asupra unei gene sau grup de gene.

Se apreciaza ca cel putin 20% dintre mutatiile genice nu vor fi observate pentru ca actioneaza doar asupra unor baze care nu se inscriu in codul genetic.

Manifestarea unor mutatii este diminuata si datorita prezentei unor gene numite gene reglatoare sau represoare.

Pentru a putea identifica mai usor formele mutante se practica o serie de metode printre care cosangvinizarea, retroincrucisarea, incrucisarea succesiva.

Cosangvinizarea conduce la homozigotarea genelor recesive care au fost afectate de mutatii si astfel se manifesta in fenotip.

In vederea selectiei se practica notarea conventionala in felul urmator: planta, organul sau samanta tratata se considera in generatia M₀, rezultatul obtinut dintr-o planta la care s-a actionat cu un agent mutagen se considera in generatia M₁ si apoi generatiile M₂ M₃ M₄ samd si daca se folosesc radiatii ionizante sau neionizante se noteaza cu X₀, X₁, X_2, X₃ samd.

In generatia M₁ plantele sunt heterozigote in privinta mutatiilor provocate si din acest motiv nu pot fi identificate formele mutante.

Se observa totusi unele malformatii in cazul agentilor chimici sau unele radiomorfoze in cazul radiatiilor dar care nu au valoare ameliorativa.

In aceasta generatie se aleg elitele numai dupa caracterele morfologice la speciile alogame. Pentru a preintampina polenizarea cu polen strain se izoleaza inflorescentele, se face autopolenizarea fortata, semintele se recolteaza separat de la fiecare planta si se urmaresc in descendenta.

In generatia M₂ sau X₂ pot aparea unele forme mutante si abia din aceasta generatie incepe procesul efectiv de selectie, astfel semintele fiecarei plante se recolteaza separat si se seamana pe cate un rand in anul urmator in campul de selectie cu forme mutante, in generatia M₃ se continua alegerea elitelor pana la homozigotarea totala a genelor iar exemplarele obtinute se vor utiliza fie ca forme mutante fie ca surse de germoplasma in alte procese de ameliorare.

Folosirea mutatiilor in ameliorarea plantelor - cercetarile in mutageneza sunt utilizate in ameliorarea plantelor indeosebi pentru transformarile, in special micromutatiile, singurele utile in procesul de creare a materialului biologic.

Utilizarea formelor mutante este posibila in 3 directii si anume: introducerea acestora direct in productie, folosirea ca material initial de ameliorare si folosit pentru realizarea unor obiective speciale.

Utilizarea direct in productie constituie cea mai eficienta directie de utilizare, teoretic prin aparitia formelor mutante, selectia, identificarea si selectia acestora, se reduce timpul de creare a noilor soiuri aproape la jumatate si in acelasi timp cu reducerea costurilor pentru realizarea soiului respectiv, de obicei direct in productie se introduc formele mutante identificate in M₁ daca sunt dominante si cele identificate in generatia M₂ dupa homozigotare daca mutatiile sunt recesive.

Micromutatiile care sunt cele mai importante, pot fi identificate cel mai devreme in generatia M₃ cand se manifesta fenotipic dar cel mai sigur in M₄, M₅.

Folosirea ca surse de germoplasma sau ca material initial in unele procese de ameliorare, cel mai adesea formele mutante care nu se introduc direct in productie se utilizeaza ca si genitori in lucrarile de hibridare pentru ca insusirile si caracterele pe care le-au obtinut prin mutageneza sa se poata combina cu insusirile si caracterele altor genitori in vederea armonizarii acestora si crearii unui soi superior din acest punct de vedere.

Astfel se pot incrucisa fie 2 forme mutante diferite direct si reciproc fie doar unul dintre genitori este o forma mutanta si celalalt genitor este neafectat de mutatii, fie o forma mutanta poate constitui un donor de la care sa se transfere mutatia respectiva prin decrossare, prin hibridare recurenta la un alt genitor deficitar pentru caracterul sau insusirile conditionate de forma mutanta.

Folosirea mutatiilor pentru realizarea unor obiective speciale - cresterea variabilitatii in cadrul natural initial, introducerea formelor mutante in campurile de analiza in amestec cu formele neafectate pentru hibridare libera in vederea obtinerii recombinarilor genetice.

Se incearca cu rezultate bune inducerea mutatiilor pentru obtinerea de soiuri de plante rezistente la pesticide, soiuri rezistente la agentii fitopatogeni, soiuri rezistente la actiunea factorilor nefavorabili de mediu, si aici intram in organismele modificate genetic cand prin metode specifice se pot transfera aceste gene de rezistenta la plantele de cultura, fie cu ajutorul unor vectori care transporta unele plasmide de la Bacillus turingiensis in urma carora rezulta plantele BT sau plasmide de la Agrobacterium tumefaciens care se folosesc in acelasi scop.

Poliploidia se cunoaste ca in celulele somatice precum si in celulele genetice ale unei specii exista un numar constant de cromozomi.

In specia de origine, specia ancestrala, numarul total de cromozomi poarta numele de baza sau garnitura cromozomica de baza si intotdeauna se noteaza cu x.

Ca urmare a evolutiei, a actiunilor omului, numarul de cromozomi la fiecare specie a suferit modificari atat in celula somatica cat si in celula gametica.

In gameti intotdeauna numarul de cromozomi se noteaza cu n, acest n poate fi n = x la speciile originare si poate fi corect la speciile originare, la exemplarele originare ale unei specii si mai poate fi un multiplu de x ca urmare a evolutiei sau a actiunii omului.

In zigot numarul de cromozomi se noteaza cu 2x pentru exemplarele ancestrale si cu 2n pentru cele aparute ca urmare a numeroaselor modificari care au avut loc, astfel la majoritatea speciilor de plante exista serii asa numite poliploide la care 2n poate fi egal cu 3x, 4x, 5x, 6x si chiar 8x.

La Allium porum numarul de cromozomi de baza x este 8 si 2n = 4x = 32 cromozomi;

La Cerasus vulgaris x = 8, 2n = 4x = 32 cromozomi;

La speciile de crizanteme x = 9 cromozomi, 2n = 3x, 4x, 5x = 27 cromozomi, 36 cromozomi si 45 de cromozomi;

La Fragaria moscata x = 7 cromozomi, 2n = 6x = 42 cromozomi;

La Fragaria ananasa x = 7 cromozomi, 2n = 8x = 56 cromozomi;

La Malus pumilla x = 17 cromozomi, 2n = 2x, 3x, 4x = 34 cromozomi, 51 cromozomi, 78 cromozomi;

La Pirus communis x = 17 cromozomi, 2n = 2x, 3x = 34 cromozomi, 51 cromozomi;

La Prunus spinosa x = 8 cromozomi, 2n = 4x = 32 cromozomi;

La Prunus domesticai x = 8 cromozomi, 2n = 6x = 48 cromozomi;

La Rubus exista intreaga serie poliploida x = 7 cromozomi, 2n = 2x = 14 cromozomi, 3x = 21 cromozomi, 4x = 28 cromozomi, 5x = 35 cromozomi, 6x = 42 cromozomi, 7x = 49 cromozomi, 8x = 56 cromozomi;

La Vitis vinifera x = 19, 2n = 2x = 38 cromozomi, 4x = 76 cromozomi.

Importanta poliploidiei - poliploidia poate aparea ca urmare a actiunii unor factori poliploidizanti fie naturali sau artificiali introdusi de actiunea omului.

Exista in natura o frecventa mare a formelor poliploide aparute natural si timp de peste 40 de ani s-au efectuat studii asupra acestor forme.

Se cunoaste ca numarul de cromozomi pentru o specie se mentine constant de la o generatie la alta timp cat fecundarea, mitoza, meioza se desfasoara normal.

In procesul de dezvoltare al plantelor se cunosc 2 etape din punct de vedere citologic si anume: diplofaza caracterizata prin prezenta a 2n cromozomi si haplofaza caracterizata prin prezenta a n cromozomi.

Diplofaza incepe in momentul formarii zigotului si se termina in momentul in care incepe meioza.

Haplofaza incepe odata cu meioza in urma careia iau nastere cele 2 celule sexuale, fiecare cu cate n cromozomi si se incheie prin contopirea celor 2 celule si formarea zigotului.

In fapt cele 2 faze amintite sunt reprezentate astfel: haplofaza prin celulele sexuale adica graunciorii de polen si ovulele iar diplofaza prin radacina, tulpina, ramuri, frunze si flori.

Haplofaza reprezentata de celulele gametice are n cromozomi in fiecare celula in parte, diplofaza reprezentata de celulele somatice prezinta 2n cromozomi.

In procesul de perpetuare a fiecarei specii, are loc o permanenta alternanta intre haplofaza si diplofaza si ca urmare a acestei alternante, numarul de cromozomi al unei specii se mentioneaza constant de la o generatie la alta, uneori insa se intampla ca plantele diploide sa produca urmasi la care celulele somatice contin mai mult de 2 garnituri cromozomice care provin de la cele 2 celule sexuale, acest fapt poate sa intervina datorita unor perturbari care pot sa aiba loc in procesul de fecundare in mitoza, in meioza, perturbari care conduc la multiplicarea numarului de cromozomi.

Plantele care au un numar multiplu de garnituri cromozomice poarta numele de plante poliploide si in functie de numarul de garnituri intalnim specii triploide, tetraploide, pentaploide, hexaploide, samd.

Modificarea numarului de garnituri cromozomice poarta numele de mutatii de genom sau mutatii poliploide si care au drept efect fie multiplicarea numarului de garnituri cromozomice fie modificarea numarului de cromozomi care alcatuiesc garnitura diploida.

Odata cu cresterea numarului de garnituri cromozomice va creste si numarul alelelor care conditioneaza un anumit caracter si astfel manifestarea acestuia in fenotip va fi mult mai evidenta fiind una din posibilitatile de identificare a exemplarelor poliploide. Astfel de exemplare prezinta importanta pentru evolutia speciei demonstrand ca o mare parte din speciile cultivate sunt poliploizi naturali, prezinta importanta pentru ameliorare in sensul ca la aceste exemplare creste potentialul productiv si astfel se inregistreaza substantiale sporuri de productie.

Poliploidia influenteaza si unele procese fiziologice astfel: cantitatea de hidrati de carbon, de grasimi, proteine, vitamine, saruri minerale este intotdeauna mai mare la formele poliploide comparativ cu cele diploide.