MARKERI GENETICI SI MARKERI MOLECULARI

Markerii genetici sunt alele mutante care marcheaza prezenta unei gene la nivel individual si controleaza caractere usor evidentiabile, marcante. Sunt de doua feluri:

markeri morfologici, markeri care controleaza caractere morfologice - ex. culoarea bobului la porumb (gena R^r pentru culoarea rosie, gena R^st pentru boabe pestrite, gene localizate pe cromozomul 10; gena wx localizata pe cromozomul 9 pentru aspectul ceros al bobului).

markeri biochimici care controleaza insusiri biochimice.

La randul lor, markerii biochimici sunt de mai multe feluri:

1. markeri izoenzimatici - sunt reprezentati de gene care codifica izoenzimele;
2. markeri auxotrofi - specifici bacteriilor, sunt forme mutante, incapabile sa sintetizeze un anumit component (de regula aminoacid) pe care formele salbatice, prototrofe, il pot sintetiza (ex. met^-, his^-);
3. markeri de rezistenta - ex. gena de rezistenta la antibiotice: Ap^R (rezistenta la ampicilina), Km^R (rezistenta la kanamicina ) etc;
4. markeri de deficienta - sunt alele mutante ce codifica enzime nefunctionale (NR^- - nitrat reductaza, nu permite supravietuirea pe mediu cu azot nitric, numai pe mediu cu azot amoniacal);

Din punct de vedere al ingineriei genetice, markerii pot fi:

1. markeri de selectie, care permit selectia celulelor transformate prin utilizarea unui mediu de selectie pe care formele netransformate nu pot supravietui. De regula sunt markeri de rezistenta. De exemplu forma rezistenta la ampicilina poate supravietui pe un mediu cu ampicilina.
2. markeri de detectie, care permit identificarea tesuturilor transformate.

Tipuri de markeri de detectie

Markerul GFP s-a izolat de la medusa Aequoria vectoria, este cel mai modern, nu omoara celula sau tesutul pentru evidentiere.

Markerii moleculari - sunt markeri genetici care pot marca prezenta unei gene la nivelul ADN-ului.

Caracteristicile markerilor moleculari

1. pot fi obtinuti in numar nelimitat, din orice tesut, in orice etapa de dezvoltare;
2. sunt independenti de expresia genica si nu sunt influentati de conditile de mediu;
3. nu sunt supusi presiunii de selectie;
4. de regula, nu prezinta interactiuni nealelice (epistatice) si nu manifesta pleiotropie;
5. se transmit mendelian, simplu;
6. pot fi dominanti, cand nu se deosebesc heterozigotii de homozigoti sau codominanti, cand se pot deosebi heterozigotii de ambii parinti homozigoti.

Clasificarea markerilor moleculari

I.Markeri care permit evidentierea polimorfismului monolocus

1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism);
2. PCR (Polymerase Chain Reaction), cu urmatoarele tipuri:

CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences);

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism);

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

SSR (Simple Sequences Repeats) sau markeri ADN microsatelit.

II.Markeri care permit evidentierea polimorfismului polilocus (la gene diferite sau cromozomi diferiti)

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) cu urmatoarele tipuri:

DAF (DNA Amplified Fingerprinting)

AP - PCR (Arbitrary Primed PCR)

ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).

Markeri RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Se bazeaza pe polimorfismul molecular al formelor parentale, la nivel allelic, in ceea ce priveste lungimea si numarul fragmentelor de restrictie obtinute prin digestia enzimatica a ADN-lui genomal cu enzimede restrictie (enzime care taie ADN-ul in situsuri specifice).

Fragmentele de restrictie se evidentiaza in urma hibridarii moleculare cu o anumita sonda (sonda este o secventa de ADN complementara genei care se doreste a fi identificata). Daca sonda este radioactiva, hibrizii moleculari (fragmentele de restrictie pe care s-a fixat sonda) se releva prin autoradiografie.

Enzimele de restrictie sunt codificate de gene plasmidiale si sunt specifice anumitor specii si genuri bacteriene. O enzima de restrictie recunoaste la nivelul ADN-ului un situs de restrictie, la nivelul caruia poate produce taierea moleculei de ADN. In urma taierii rezulta capete monocatenare adezive 5' sau 3' si capete bonte. Situsul de restrictie poate fi reprezentat de 4, 6 sau 8 nucleotide (perechi de baze).

Simbolizarea enzimei de restrictie se face cu prima litera a cuvantului ce desemneaza genul, doua litere pentru specia bacteriana.

Exemplu:

Eco R₁ - Escherichia coli, plasmid R

↓

- recunoaste situsul 5' G A A T T C 3'

3' __________ 5' (capete adezive)

C T T A A G

↑

__ G 5' A A T T C

C T T A A 5' G

UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI RFLP

IN STUDIILE DE GENETICA SI IN AMELIORAREA PLANTELOR

Referat: Analizatorul gustativ - implicat in realizarea simtului gustativ Document online: Creierul mare - neuronii piramidali, stelati si fuziformi

Exista doua directii de utilizare a markerilor moleculari RFLP in studiile de genetica:

a.     cartarea genetica;

b.     clonarea genelor.

a.     Cartarea genetica

Markerii RFLP se pot obtine in numar nelimitat. Fiecare marker este definit de o anumita sonda (se obtin benzi de o anumita dimensiune). Localizarea sondelor in cadrul grupelor de inlantuire se face pe baza unor analize genetice clasice, iar distanta dintre gene se exprima in centimorgan (cM).

Pentru ca o harta genetica sa fie saturata, se apreciaza ca distanta dintre doi markeri trebuie sa fie de maxim 20 cM. (Ex. Genomul de porumb are 14000 cM; 14000:20=700 (sunt necesari 700 markeri). Pentru a se putea realiza cartarea, markerii moleculari trebuie sa fie polimorfi, adica alelele sa se poata evidentia. Prima data se analizeaza polimorfismul formelor parentale. Se apreciaza ca in general la alogame polimorfismul este mai mare. Populatiile segragante de cartare se obtin in urma hibridarii intraspecifice. La autogame polimorfismul este mai mic iar populatiile segregante de cartare se obtin prin hibridari interspecifice.

Populatiile de cartare pot fi reprezentate de populatii segregante F₂ sau de populatii testcross (backcross). Aceste populatii nu sunt stabile in descendenta si in consecinta ele trebuie reconstituite prin a. mentienrea populatiilor F₂ sau testcross prin multiplicare vegetativa si b. crearea populatiilor RI (Recombinant Inbreed). Populatiile RI se obtin prin autopolenizare si selectie individuala timp de mai multe generatii.

b.Clonarea genelor cu ajutorul markerilor RFLP

Pentru clonarea genelor este necesara o forma mutanta a genei ce urmeaza a fi clonata, ce poate fi complementata de forma ei salbatica. Este de asemenea necesara stabilirea relatiilor de inlantuire intre gena de clonat si diferiti markeri genetici. Se alege markerul genetic cel mai apropiat (in cM).

Marker RFLP         gena ce urmeaza a fi clonata

↓ ↓

_____X__________________ ▒_________________

Sonda ce defineste acest marker este utilizata in cadrul unui proces de hibridare moleculara a unei banci de gene de tip YAC (Yeast Artificial Chromosome - cromozom artificial de drojdie). Sonda ce defineste markerul este folosita in contextul unei hibridari moleculare ce permite identificarea clonei YAC A. Capatul clonei este decupat, markat si utilizat ca sonda pentru identificarea clonei YAC B. Capatul clonei YAC B este decupat, markat si utilizat ca sinda pentru identificarea clonei YAC C (tehnica Chromosome Walking sau Map Based Cloning). Pentru a stabili care sonda poarta gena de interes se apeleaza la testul de complementaritate, adica utilizarea clonelor pe rand, in contextul transformarii genetice.

Daca la forma transformata genetic se restaureaza fenotipul salbatic dominant, rezulta ca, clona respectiva (YAC C) poarta gena de interes.

Utilizarea markerilor moleculari RFLP in ameliorarea plantelor

Directii de utilizare:

selectia asistata de markeri moleculari (MAS);

reconsiderarea strategiilor de ameliorare;

maximizarea heterozisului;

protectia noilor creatii.

Selectia asistata de markeri moleculari

Markerii moleculari permit selectia mai eficienta a recombinarilor utile, ameliorarea pierzandu-si caracterul probabilistic.

In cazul caracterelor calitative, daca se constata existenta unor inlantuiri stranse intre un anumit marker si o gena utila, se poate face selectie indirecta eficienta, pe baza de markeri moleculari, vizand ameliorarea insusirii controlate de gena cu care markerul este inlantuit. Avantajul utilizarii markerilor moleculari este ca acestia nu sunt influentati de conditiile de mediu.

Caracterele cantitative (care au un determinism poligenic) pot fi descompuse in elementele componente, numite QTL (Quantitative Trait Loci).

Cum se procedeaza?

O populatie segreganta F₂ este caracterizata molecular pentru mai multi markeri. Indivizii sunt in acelasi timp masurati in privinta exprimarii caracterului respectiv. Pentru fiecare marker se face o grupare a indivizilor pe genotipuri fomozigote si heterozygote.

Eficienta selectiei depinde de distanta dintre marker si QTL si de masura in care caracterul cantitativ este definit de markerul molecular.

Reconsiderarea strategiilor de ameliorare

In ameliorarea clasica a plantelor exista doua metode de baza: a. selectia in masa bazata doar pe selectia fenotipica, fara verificarea elitelor in descendenta si b. selectia individuala genotipica, care presupune verificarea valorii elitelor in descendenta. Selectia in masa este foarte eficienta, necesita un timp mai scurt dar poate fi aplicata numai pentru caracterele cu un coeficient de heritabilitate (h²) ridicat. La caracterele cu un coeficient de heritabilitate scazut se recomanda selectia individuala genotipica.

Selectia clasica in masa sau individuala se dovedeste eficienta mai ales pentru caracterele controlate de gene cu efecte aditive semnificative (a²).

In cazul markerilor moleculari, acestia nefiind influentati de mediu, heritabilitatea este 100%. In acest caz, se poate face selectia si pentru caractere cu heritabilitate scazuta si aditivitate redusa.  

Maximizarea heterozisului

Maximizarea heterozisului se bazeaza pe determinarea distantelor genetice la formele parentale pe baza de markeri si alegerea parintilor cei mai diferiti. Sporirea efectului heterozis implica determinarea distantelor genetice intre diferitele forme, pe baza analizei unor profiluri electroforetice multilocus numite fingerprint (mai multe benzi electroforetice). Pentru a obtine astfel de profile se utilizeaza un tip particular de sonde - sonde ADN mitocondrial si sonde ADN-minisatelit.

ADN-ul mitocondrial este puternic variabil, de dimensiune foarte variabila, dar totusi caracteristic unei specii.

Profil electroforetic asemanator = distante mici;

Profil electroforetic diferit = distante mari.

Protectia noilor creatii

Fiecare soi are amprenta sa genetica, un anumit profil electroforetic de tip fingerprint, care nu poate fi modificat.

Markeri PCR (Polymerase Chain Reaction)

Marcarea PCR se bazeaza pe polimorfismul molecular la nivel alelic in ceea ce priveste lungimea produsilor de amplificare obtinuti prin primeri specifici, complementari capetelor 3' ale secventelor de ADN ce urmeaza a fi amplificate.

Produsii de amplificare sunt separati electroforetic prin migrare in gel de agaroza si sunt evidentiati dupa o colorare prealabila cu bromura de etidium in ultraviolet.

3'→ 5'

_______________ Reactia PCR este un proces de replicare repetata

_______________

5' ← 3'

Tehnica de lucru

Amestecul de reactie pentru amplificare (25 μl) are urmatoarele componente:

tampon (Buffer) - specific enzimei cu care se lucreaza;

MgCl₂  (25 micromoli)

Amplificarea PCR se realizeaza prin utilizarea a doi primeri specifici, complementari capetelor 3^' a fragmentului ce urmeaza a fi amplificat. Amplificarea se realizeaza cu ajutorul unui termocicler (un calculator) in cadrul a mai multor cicluri de replicare. Fiecare ciclu are 3 segmente:

-denaturare

-fixare primer

-extensie

La marcarea PCR primerii au in jur de 20 perechi nucleotidice.

Produsii de amplificare sunt separati electroforetic in gel de agaroza si se evidentiaza in lumina ultravioleta dupa o colorare cu bromura de etidiu.

Tipuri speciale de PCR

IPCR (inverted PCR) si APCR (ancored PCR) sunt tehnici care permit amplificarea unor secvente necunoscute, plecand de la o secventa cunoscuta.

AsPCR (asimetric PCR) permite amplificarea unor secvente monocatenare

Utilizarea marcarii PCR

a. Selectia asistata de markeri moleculari - markerii PCR pot fi utilizati deoarece permit genotiparea, adica stabilirea starii homo- sau heterozigote. In acest sens exista trei tehnici: CAPS (RFLP = PCR), SSCP si DGGE.

b. Se poate utiliza pentru confirmarea existentei unei gene sau a confirmarii naturii transgenice in urma transgenezei;

c. Se poate folosi in scop de diagnostic;

c.      Se poate utiliza in criminalistica (testul ADN).

Markeri microsatelit (SSR Simple Sequence Repeats)

Secventele microsatelit constituie repetitii in tandem ale unor fragmente ADN scurte, de 1-4 perechi de baze. Cele mai frecvente repetitii sunt cele dinucleotidice , de exemplu (CA)_n, (CT)_n, (AT)_n, care se repeta dupa 30-100 kb. La plantele superioare, secventa cel mai frecvent intalnita este (AT)_n. Polimorfismul microsatelitilor este dat de numarul de secvente nucleotidice care se repeta.

In masura in care se cunoaste ordinea nucleotidelor la secventele invecinate microsatelitilor, se pot concepe primeri specifici, care vor permite amplificarea fragmentelor ADN, ce inglobeaza microsatelitii. Variabilitatea markerilor microsatelit se datoreaza diferentelor de lungime a fragmentelor ADN amplificate.

Markerii SSR sunt codominanti, permitand identificarea tuturor alelelor.

Markeri RAPD

Se bazeaza pe aceleasi principii ca si marcarea PCR, cu deosebirea ca pentru amplificare se utilizeaza un singur primer decamer, care se gaseste la nivelul genomului, randomizat, la un situs de fixare care sa-i permita realizarea amplificarii. Produsii de amplificare urmeaza a fi separati in gel de agaroza si se evidentiaza in UV dupa colorarea cu bromura de etidium. Produsii de amplificare apar sub forma unor benzi fluorescente in lumina UV. Pentru obtinerea produsilor de amplificare, conditia esentiala este ca primerii arbitrari sa aiba un continut de guanina si citozina de cel putin 50%.

Avantajele tehnicii RAPD

nu pezinta riscuri deoarece nu implica radioactivitatea;

cantitatea de ADN necesara pentru caracterizare este relativ redusa;

permite diferentierea speciilor, a subspeciilor si a cultivarelor.

Dezavantaje

produsii de amplificare sunt in numar relativ redus;

markerii RAPD sunt dominanti;

repetabilitatea metodei este relativ redusa, fiind influentata de conditiile de lucru si aparatura utilizata.

Utilizarea markerilor moleculari

In studiile de genetica markerii moleculari pot fi utilizati pentru cartarea genetica (harti genetice), pentru izolarea si clonarea unor gene, in ameliorarea plantelor. Markerii moleculari se pot utiliza pentru eficientizarea procesului de selectie MAS (marker assisted selection), pentru reconsiderarea strategiilor de ameliorare, pentru maximizarea efectului heterozis, protejarea noilor creatii, pentru evidentierea variabilitatii somaclonale si pentru confirmarea hibrizilor somatici.

Pentru eficientizarea procesului de selectie este necesara atribuirea markerilor unor gene de interes (stabilirea relatiilor de linkage intre marker si gena de interes). In aceste conditii se poate face o ameliorare directa a caracterelor dorite pe baza urmaririi markerilor. In cazul caracterelor cantitative, acestea pot fi descompuse in elemente componente QTL (Quantitative Traits Loci), care se transmit mendelian. Dupa caracterizarea moleculara a parintilot si determinarea QTL se pot allege parintii cei mai complementari, care sa asigure exprimarea la maxim a caracterului dorit.

Reconsiderarea strategiilor de ameliorare se refera la posibilitatea aplicarii selectiei in masa chiar pentru caracterele cu o heritabilitate scazuta.

Maximizarea heterozisului se bazeaza pe determinarea distantelor genetice la formele parentale pe baza de markeri si alegerea parintilor cei mai diferiti.

Protectia noilor creatii poate fi asigurata ca urmare a faptului ca fiecare soi are o anumita amprenta moleculara, care nu poate fi falsificata.

INGINERIA GENETICA

Ingineria genetica este reprezentata de totalitatea metodelor si tehnicilor prin care se actioneza "in vitro" asupra genelor, cromozomilor sau celulelor cu scopul obtinerii unor structuri genetice noi, posibil prestabilite.

Ingineria genetica se delimiteaza de restul biotehnologilor prin scopul propus si anume, obtinerea unor structuri genetice noi.

Domenii specifice

a. Transgeneza

b. Hibridarea si cibridarea celulara

c. Haploidia prin androgeneza si ginogeneza

d. Variabilitatea somaclonala

e. Mutageneza dirijata

Importanta

- Prin inginerie genetica se pot realiza obiective greu sau imposibil de realizat cu metode clasice.

Se pot transfera gene de la eucariote la procariote in vederea clonarii si recoltarea produsului genelor clonate din mediul de cultura (asa s-a obtinut interferonul, insulina,etc.).    

- Se pot transfera gene de la procariote la eucariote. Pentru exprimare, gena trebuie sa fie echipata cu promotorul specific celulei gazada. Pe aceasta cale s-au obtinut plante rezistente la erbicide neselective, la virusuri, bacterii, ciuperci, insecte, etc.

Presupune introducerea in cadrul unei celule gazda , prin intermediul unui vector (V) a unei gene straine numite pasager (P), celula gazda suferind astfel un proces de transformare genetica (gena se poate replica si exprima in celula gazda)

Transformarea genetica (sau transgeneza) la procariote

Obiectivul principal il reprezinta clonarea genelor, adica multiplicarea lor odata cu V si cu bacteriile.

Prin clonare se urmareste recoltarea produsului de expresie al genei transferate, modificarea genei transferate prin mutageneza dirijata, caracterizarea genei (secventierea).

Etapele clonarii

izolarea V

obtinerea pasagerului

integrarea pasagerului in vector (V+P = ADN recombinant)

introducerea ADN-ului recombinant in celula gazda

selectia celulelor gazda ce poarta ADN recombinant

selectia celulelor gazda ce poarta un anumit pasager      

1. Izolarea vectorului.

Caracteristicile vectorilor sunt:

- vectorul trebuie sa fie un replicon (molecula de ADN capabila de autoreplicare)

vectorul nu trebuie sa fie foarte mare (2-5 kb)

vectorul sa poarte markeri genetici necesari selectiei celulelor transformate

vectorul sa poata integra specific pasagerul

Vectorii actuali poarta secvente polilinker (MSC) reprezentate de secvente unice de restrictie, dispuse in tandem. Ex. de vectori: plasmidele, fagul lambda, vectorul YAC. Acestia pot sa integreze pasageri de la aproximativ 15 kb pana la 1 Mb.

2. Obtinerea pasagerului

Pasagerul poate fi obtinut prin

a. digestie enzimatica cu enzime de restrictie a ADN-ului genomal;

b. reverstranscriere a ARN-ului mesager, rezultand ADN complementar (cADN);

c. amplificare PCR;

d. sinteza artificiala.

Enzimele de restrictie sunt enzime codificate de gene plasmidiale, capabile sa recunoasca o anumita secventa nucleotidica (situs de restrictie) din patru pana la opt perechi de baze, la care poate sa produca o ruptura. Unele enzime, in urma acestei taieri pot sa determine formarea unor capete monocatenare adezive.

3. Integrarea pasagerului in vector

Se face diferentiat, in functie de modul de obtinere a pasagerului. Daca pasagerul a fost obtinut prin digestie cu o enzima de restrictie, vectorul trebuie sa fie digerat cu aceeasi enzima de restrictie. Astfel, rezulta capete adezive monocatenare, comple-mentare, iar pasagerul se integreaza in vector pe baza de complementaritate. Legarea covalenta a nucleotidelor vecine din dreptul rupturii se face in prezenta ADN-ligazei.

4. Introducerea ADN-ului recombinant in celula gazda

Se poate face prin transformare genetica bacteriana, daca pasagerul nu este foarte mare. Daca pasagerul este mare se poate interveni prin electroporare sau cu polietilenglicol (PEG). In cazul fagilor, introducerea se face prin infectie.

5. Selectia celulelor gazda ce poarta ADN recombinant

Se realizeaza prin inactivarea de insertie a unor markeri.

De ex. la bacteriile salbatice exista o enzima, β-glucoronidaza, care poate sa transforme un substrat cromogen, x-gal, intr-un produs albastru.

6.Selectia celulelor gazda ce poarta un anumit pasager

Totalitatea ADN-ului recombinant reprezinta o banca de gene. Selectia se face pe doua cai: prin hibridare moleculara si cu ajutorul metodelor imunologice.

In cazul hibridarii moleculare, ADN-ul recombinant denaturat se hibrideaza cu o sonda, eventual radioactiva, monocatenara, pe baza de complementaritate (sonda va realiza un hibrid molecular doar cu pasagerul cu care este complementar). Identificarea hibridului molecular se face prin autoradiografie.

Metodele imunologice permit identificarea genei de interes in mod indirect pe baza produsului de expresie proteica a acesteia, proteina identificata cu ajutorul unor anticorpi specifici, eventual radioactivi.

Transformarea genetica la eucariote

Obiectivul principal il reprezinta regenerarea plantelor transgenice din celulele transformate, plante la care gena transferata este capabila sa se exprime. Pentru o exprimare stabila este necesar ca gena sa se integreze in materialul genetic al gazdei. Transformarea genetica este un proces integrativ. Plantele transgenice se mai numesc si OMG (organisme modificate genetic).

Dupa modul de introducere a ADN-ului recombinant in celula gazda exista doua grupe de metode: transformarea prin metode directe si prin metode indirecte.

Prin metode indirecte, ADN-ul recombinant este introdus in celula gazda prin intermediul unui agent natural de transfer (Agrobacterium tumefaciens - produce cancerul bacterian al plantelor si A. rhizogene - produce fenomenul Hary roots, radacini filiforme).

La bacteria A. tumefaciens tumoarea reprezinta tesut vegetal transformat genetic in mod natural, de catre bacterie. Responsabila de producerea tumorii (opinelor) este plasmida. Opinele sunt analogi ai aminoacizilor utilizate de bacterie ca sursa de azot si carbon.

In procesul de infectie si inducere a tumorii, bacteria se apropie de tesutul ranit pe baza de chemotropism. In celula este transferata secventa T- ADN care se integreaza natural in cromozomul gazda.

Pentru transferarea secventei T - ADN sunt responsabile genele VIR.

Ingineria genetica cauta sa utilizeze acest proces natural de transformare genetica, inlocuind genele responsabile de formarea tumorilor cu gene utile si markeri genetici (pentru selectia celulelor transformate)

Prin metode directe ADN-ul recombinant este introdus in mod direct in celula gazda fara interventia unui agent natural de transfer.

Tansformarea directa se poate realiza pe urmatoarele cai:

a. Transformarea directa a protoplastelor

b. Electroporarea si porarea laser

c. Microinjectia

d. Macroinjectia

e. Metodele biolistice

a.Transformarea genetica a protoplastelor

Protoplastele sunt celule nude, lipsite de perete celular, dar cu membrana celulara. Peretele celular este eliminat prin digestie cu enzime litice (celulaza, pectinaza).

ADN-ul recombinant patrunde in interiorul protoplastelor prin endocitoza. Celulele din protoplastele transformate vor forma calus transformat, din care se vor regenera plante transformate.

Regenerarea se face prin embriogeneza (formarea unui proembrion) sau prin organogeneza (formarea lastarilor si apoi inradacinarea).

b.Electroporarea si porarea laser

Pe aceasta cale se creaza pori reversibili la nivelul celulei vegetale cu ajutorul unui curent electric continuu, pulsatoriu sau cu ajutorul radiatiei laser. Metoda se poate aplica atat la protoplaste cat si la tesuturi.

c.Microinjectia

Se aplica in special la animale si consta in introducerea in interiorul nucleului a ADN-ului recombinant cu ajutorul unei seringi sau a unui micromanipulator.

d.Macroinjectia

Consta in pulverizarea unei suspensii de ADN recombinant in inflorescenta, dupa polenizare.

e.Metodele biolistice

Introducerea ADN-ului recombinant in tesutul gazda are loc sub actiunea unei forte de explozie, rezultata in urma aprinderii unei incarcaturi explozive (metoda tunului de particule - ADN-ul este fixat la suprafata unor microproiectile de tungsten sau aur) sau in urma ruperii unei membrane de grosimi diferite sub actiunea heliului de presiune ridicata.

In cazul metodei arcului electric are loc pulverizarea unei picaturi de apa, sub actiunea unui curent electric, la o tensiune de 800 de volti.

Confirmarea transformarii se face prin metode histobiochimice sau prin metode moleculare (PCR sau Southern Blotting).

REALIZARI PRIVIND TRANSFORMAREA GENETICA

A PLANTELOR DE CULTURA

I. Ameliorarea rezistentei la virusuri

Majoritatea virusurilor sunt virusuri cu filament pozitiv, la care informatia genetica poate fi tradusa. In procesul infectiei virale patrunde virusul matur (ARN + capsida + material genetic).

Mijloace clasice de control a infectiei virale

combaterea agentilor vectori

cultivarea unui material de plantare liber de viroze, obtinut prin culturi de meristeme, cu aplicarea eventuala a termoterapiei

efectuarea unor infectii incrucisate (infectarea cu o tulpina mai putin virulenta si obtinerea unei imunitati fata de tulpinile mai virulente)

hibridarea si selectia (metoda clasica)

Metode specifice ingineriei genetice

transgeneza si fuziunea de protoplaste

Transgeneza

1.Transferul unor gene de rezistenta, izolate si clonate (gene provenite de la plante rezistente sau de la animale).

2.Transferul unor gene de tip viral (PDR).

Ex.a) Genele ce codifica proteinele de capsida sunt integrate in genomul gazdei. Plantele transgenice ce poarta aceste gene produc proteine de capsida, fapt ce determina decapsidarea virusului infectant, care nu se mai replica.

b) Strategia antisens presupune transferul unor secvente genice virale ce se transcriu sub forma de ARN complementar capatului 5^' sau 3^' a genomului viral. Daca ARN-ul este complementar cu 5^' blocheaza translatia, iar daca este complementar cu 3^' blocheaza replicarea.

c) Strategia sens urmareste transferul unor secvente genomice virale care se transcriu sub forma de ARN sens de tip viral, identic capatului 3^' de initiere a replicarii. Aceste secvente, produse constitutiv in celula gazda intra in competitie pentru replicarea virala cu virusul infectant.

II. Ameliorarea rezistentei la bacterii si ciuperci

Metoda de baza este transgeneza, dar se poate folosi si fuziunea de protoplaste.

a)     transgeneza genelor ce codifica proteine implicate in rezistenta umorala a insectelor. Ex. de proteine: cecropine, apidecine (produse de albine) etc.

b)     transgeneza genelor ce codifica proteine implicate in procesul de patogeneza. Ex.: proteine implicate in sinteza ligninelor, proteine cu proprietati antimicrobiene, antifungice sau antibacteriene, izoflavonoide.

c)      Transgeneza genelor ce codifica proteine capabile sa detoxifice toxinele. Ex. gena ttr care codifica o enzima capabila sa detoxifice tabloxina produsa de pseudomonas.

Ameliorarea rezistentei la atacul daunatorilor

Metoda de baza este transgeneza dar se foloseste si fuziunea de protoplaste.

a)     transferul genei ce codifica endotoxina de la Bacilus thuringiensis (bacil care produce o preendo-toxina care se transforma in intestinul insectei intr-o toxina foarte puternica pentru o anumita insecta).

Ex.: gena cry I - omoara lepidoptere (fluturi)

gena cry III - " coleoptere (gandaci)

gena cry IV - " diptere (muste)

b)     transferul genelor ce codifica proteinele PIP (protease inhibiting proteins). Proteazele sunt enzime utilizate de insecte pentru asimilarea proteinelor. Daca proteazele sunt inhibate, insecta moare de inanitie (nu mai asimileaza proteine). Sunt periculoase pentru om si animale. Metoda se poate folosi la speciile la care produsul vegetal se prelucreaza termic.

c)      transferul genelor ce codifica proteinele care inhiba amilaza (AIP)

d)     transferul genelor ce codifica lectinele (glicoproteine cu proprietati insecticide). Aceste gene nu sunt periculoase nici pentru om, nici pentru animale. Au fost izolate si clonate de la ghiocel.

e)     combaterea nematozilor care paraziteaza radacinile. Chimic, combaterea lor se face foarte greu. Prin transferul unor gene ce codifica proteine PIP, echipate cu promotori inductibili la radacini, asigura o combatere eficienta a nematozilor, partea aeriana fiind comestibila, netoxica.

Ameliorarea rezistentei la erbicide neselective si ameliorarea calitatii

1.Erbicidele selective combat anumite specii de buruieni si permit supravietuirea plantelor de cultura. Sunt toxice pentru om si animale, remanente in sol (sunt poluante, nefiind biodegradabile). Erbicidele neselective omoara toata vegetatia, atat buruienile, cat si plantele de cultura.

Prin inginerie genetica se cauta sa se obtina plante de cultura rezistente la aceste erbicide.

Ameliorarea rezistentei la Roundup (glyphosat)

La specia bacteriana Salmonella a fost izolata si clonata o gena mutanta, responsabila de sinteza enzimei EPSPS (enzima tinta). Enzima tinta este implicata in sinteza acizilor aromatici, asupra ei actionand erbicidul. Prin transferul genei respective s-au obtinut plante transgenice de porumb si soia, rezistente la acest erbicid.

- Ameliorarea rezistentei la paraquat si diquat, care sunt doua erbicide totale ce inactiveaza enzimele implicate in fotosinteza. Au ca efect acumularea de oxigen activ, toxic, conducand la stresul superoxidant care apare si in cazul erbicidului si in cazul excesului de lumina. Pe aceasta cale s-au obtinut plante de lucerna rezistente la aceste erbicide.

2.Ameliorarea calitatii

- Ameliorarea continutului in proteine. Majoritatea proteinelor de origine vegetala sunt sarace in aminoacizi cu sulf, necesari in hrana animalelor. Ameliorarea s-a realizat prin transgeneza, in urma izolarii si clonarii unei gene preluate de la o planta de origine braziliana, ce determina un continut bogat in aminoacizi cu sulf.

- La rapita exista o proteina alcatuita din doua subunitati: napina 20%, bogata in aminoacizi cu sulf si cruciferina 80%, saraca in aminoacizi cu sulf. Prin strategia antisens s-a blocat producerea cruciferinei, proteina rezultata in cantitati normale fiind alcatuita din napina. Prin mutageneza dirijata se pot introduce codoni ce specifica aminoacizi esentiali (ex.lizina).

- Ameliorarea continutului in amidon. Amidonul este un polizaharid alcatuit din 20% amiloza si 80% amilopectina. Prin strategia antisens s-a blocat amiloza, rezultand amilopectina.

- Intarzierea senescentei (imbatranirii) florilor si manipularea coacerii fructelor se poate realiza prin strategia antisens, blocand enzimele implicate in sinteza etilenei. Manipularea coacerii fructelor se poate realiza prin strategia antisens, blocand enzimele implicate in sinteza etilenei.

3. Producerea de noi compusi.

Prin inginerie genetica se pot realiza anumiti compusi nespecifici pentru plantele de cultura. Se produc tranzitoriu in urma infectiei plantelor cu un anumit virus ce poarta gena responsabila de producerea unui anumit compus.(ex. tricosantinul cu proprietati anti HIV). Compusii pot fi produsi in diferitele generatii in urma integrarii in genomul plantelor gazda a genelor responsabile de producerea respectivului produs. (ex. anticorpi impotriva hepatitei B, antigene impotriva hepatitei B - vaccin oral, producerea substantelor plastice biodegradabile de la bacteria Alcaligenes eutrophus).