Studiu de caracterizare fizico-chimica si de eficacitate dermato-cosmetica a uleiului obtinut prin presare la rece a semintelor speciei Oenothera biennis

1. Premisele si obiectivele studiului

Asa cum s-a aratat in capitolul 3 si 4, uleiul de Oenothera biennis, bogat in carotenoide si acizi grasi polisenaturati, ca si in oenotherol, este util in dermato-cosmetologie, pe de o parte pentru efectul sau cosmetic de stimulare a sintezei de colagen de tip IV, colagen prezent in jonctiunea dermo-epidermica, cat si prin efectul cicatrizant al acizilor polinesaturati

Cele doua efecte nu par a fi straine unul de altul, pentru ca procesul cicatrizarii implica si colagenosinteza [42].

Pornind de la aceste premise teoretice, studiul de fata doreste sa evidentieze printr-o metoda de imagistica cutanata (fotografii digitale prelucrate printr-un soft specific), daca uleiul de Oenothera biennis este activ in tratarea sau preventia ridurilor cutanate fotoinduse, sau cronoinduse. In acest sens, studiul de fata are doua obiective majore:

sa caracterizeze fizico-chimic uleiul de Oenothera biennis obtinut prin presare la rece,

sa evalueze imagistic daca in aplicatie topica, uleiul de Oenothera biennis produce o involutie a ridurilor cronoinduse sau a celor fotoinduse, pe subiecti umani.

2 Material si metoda

2.1. Determinari fizico-chimice ale uleiului de Oenothera biennis

Determinarea indicelui de aciditate

Indicele de aciditate reprezinta numarul de mg de KOH care neutralizeaza 1 g proba

In care:

56,11 - cantitatea de KOH, (in mg), corespunzatoare la 1ml KOH solutie 1N;

V - volumul solutiei de NaOH sau de KOH folosit la titrare, (in ml);

n - normalitatea solutiei de KOH sau NaOH;

m - masa probei luate in analiza, (in g).

Mod de lucru:

Probele de uleiuri se filteaza prin hartie de filtru dupa ce au fost in prealabil incalzite. Se cantareste intr-un pahar Erlenmeyer 1 g din proba de analizat, cu precizie de 0,01g. Se adauga 5-6 picaturi solutie de fenolftaleina, apoi se titreaza cu solutie de NaOH sau KOH pana la punctul de virare roz, persistent 1 minut.

Rezultatele se pot exprima in % acid gras sau indice de aciditate. Diferenta dintre doua probe paralele trebuie sa fie de maxim 0,05 mg KOH/g produs.

Determinarea indicelui de saponificare

Indicele de saponificare reprezinta cantitatea de hidroxid de de potasiu exprimata in miligrame, necesara pentru saponificarea totala a unui gram de grasime.

Valoarea indicelui de saponificare este conditionata de numarul de acizi grasi existenti intr-o cantitate anumita de grasime, iar acest numar este conditionat de greutatea moleculara a acizilor grasi respectivi.

Astfel, intr-un gram de grasime va intra un numar mai mic de acizi grasi cu greutate moleculara mare, cum este cazul uleiurilor vegetale (in care predomina acidul oleic). Indicele de saponificare al acestor grasimi va avea o valoare mica.

Principiul metodei:

Se supune saponificarii la cald cu potasa alcoolica o cantitate de ulei si se titreaza excesul de hidroxid de potasiu ramas dupa terminarea saponificarii. Cantitatea care a fost necesara saponificarii se deduce prin diferenta. Rezultatele se exprima in mg hidroxid de potasiu, necesar pentru saponificarea unui gram de grasime.

Mod de lucru:

Se cintaresc aproximativ 2g ulei, care se aduc cu 25 ml solutie alcoolica de hidroxid de potasiu intr-un balon de fierbere.

Se monteaza refrigerentul si se actioneaza sursa de incalzire, astfel incat sa se realizeze o fierbere moderata si uniforma. Saponificarea dureaza o ora. Pentru a evita pierderile de acizi grasi volatili, se urmareste in permanenta ca nivelul de condensare a vaporilor sa nu depaseasa treimea mijlocie a acestuia.

Dupa terminarea saponificarii se indeparteaza sursa de incalzire si se spala refrigerentul cu 5 -10 ml apa distilata calda. Dupa racire se titreaza excesul de hidroxid de potasiu cu acid clorhidric in prezenta fenoftaleinei, pana la virarea brusca a culorii din rosu in incolor.

In paralel se executa o proba martor in aceleasi conditi, dar fara ulei.

Calculul rezultatelor se face cu ajutorul formulei :

In care:

28,5-reprezinta cantitatea de hidroxid de potasiu in mg, corespunzatoare pentru 1 mi acid clorhidric solutie 0,5 N.

V-volumul acidului clorhidric in ml, folosit la tritrarea probei martor

V1- volumul acidului clorhidric in ml, folosit la tritrarea probei ce se analizeaza

m-cantitatea de ulei luata in lucru, in grame.

Determinarea indicelui de iod

Indicele de iod, reprezinta cantitatea de iod, in grame, aditionata de 100g grasime. Valoarea indicelui de iod este conditionata de proportia acizilor grasi nesaturati (numarul dublelor legaturi) din compozitia grasimilor. Prin urmare, grasimile cu un continut mare de acizi grasi nesaturati vor avea un indice de iod mai mare (cazul uleiurilor vegetale), iar cele cu un continut mic de acizi grasi nesaturati vor avea indicele de iod cu valoare mica.

Principiu metodei :

Grasimile dizolvate in cloroform aditioneaza monobromura de iod, la locul dublelor legaturi ale acizilor grasi nesaturati. Excesul de monobromura de iod pune iodul in libertate, care se titreaza cu tiosulfat de sodiu solutie 0,1 N in prezenta amidonului.

Mod de lucru:

Cantitatea de ulei luata in lucru este in functie de cantitatea corelata cu indicele de iod probabil al acesteia.

Intr-un vas de iod (cu dop rodat) de 300 ml se cantaresc la balanta analitica uleiul, se adauga 10 ml cloroform sub agitare continua pentru dizolvarea completa si 25ml solutie Hanus. Dupa omogenizare se acopera si se lasa la intuneric 30-60 de minute in functie de valoarea indicelui de iod.

Se adauga apoi 20ml solutie iodura de potasiu si 100ml apa distilata. Se titreaza cu tiosulfat de sodiu 0,1 N pana in preajma sfarsitului titrarii (culoare galben pal) cand se adauga 1ml solutie amidon si se continua titrarea, picatura cu picatura, pana la disparitia brusca a culorii albastre.

In paralel se executa o proba martor in aceleasi conditii dar fara ulei.

Calculul rezultatelorse face cu ajutorul urmatoarei formule:

In care:

Ii-indicele de iod

0,01269-reprezinta cantitatea de iod in grame, corespunzatoare la 1ml tiosulfat de sodiu solutie 0,1N;

V-volumul solutiei de tiosulfat de sodiu, in mililitri, folosit la titrarea probei martor;

V1- volumul solutiei de tiosulfat de sodiu, in mililitri, folosit la titrarea probei ce se analizeaza;

M-cantitatea de ulei, in grame luata in lucru.

Determinarea indicelui de refractie

Indicele de refractie se determina cu ajutorul refractometrului cuplat la ultratermostat, pentru realizarea temperaturi dorite, in functie de produs.

In general indicele de refractie al grasimilor, care la temperatura obisnuita sunt fluide (uleiuri vegetale) se determina la 20 C, al celor solide si semisolide dar care au punct de solidificare sub 40 C, se determina la 40 C, iar a celor cu punctul de solidificare peste 40 C se determina la 60 C. Este necesar sa se precizeze in documentele legale temperatura la care s-a facut determinarea.

Rezultatele se pot exprima ca atare, sub forma de indice de refractie sau se pot transforma in grade refractometrice. Cu ajutorul refractometrului Abbe-Zeiss se poate determina indicele de refractie cuprins intre: 1,4187-1,4922, ceea ce corespunde de la 5-100 grade refractometrice.

Aparatura:

Refractometrul ABBE - ZEISS, cuplat la ultratermostat tip HOPLER. Verificarea reglarii corecte a refractometrului se face cu ajutorul apei distilate, proaspat fiarta si racita, care are un indice de refractie specific, in functie de temperatura.

Mod de lucru:

Uleiul de analizat se purifica eliminand unele substante insotitoare (apa, substante proteice, impuritati mecanice). Pentru grasimile topite, filtrarea la cald, prin filtru curat, este suficienta.

Se aseaza refractometrul in fata ferestrei sau a unei lampi electrice. Se regleaza temperatura la 40 C sau, dupa caz la 20 C ori 60 C. Aceasta temperatura se citeste pe termometrul atasat la refractometru. Se deschid prismele se curata, cat se poate mai bine cu vata si apa distilata sau alt solvent potrivit si se usuca cu hartie de filtru, apoi pe fiecare prisma se intinde o picatura de ulei sub forma de film subtire si continuu, apoi se inchid bine. Se lasa in repaus aproximativ 2 minute, apoi prin ocularul din dreapta se potriveste regland in asa fel campul vizual (cu ajutorul ocularului si a celor doua vize), incat aceasta sa fie bine luminat, iar la limita de separatie a celor doua campuri vizuale sa fie perfect clara, cu profil rectiliniu si sa se intersecteze exact in punctul central de incrucisare al celor doua linii vizuale. In acest moment, se potriveste prin ocularul din stanga, citind pe scala valoarea indicelui de refractie.

Referat: Vitaminele - surse alimentare de vitamine Referat: 41 de sfaturi pentru viata lunga recomandate de doctor

Pentru exactitate este bine sa se repete operatia de cateva ori, iar rezultatul se exprima in media aritmetica a acestor citiri. Dupa fiecare citire cele doua prisme se curata bine cu un tampon de vata imbibata intr-un solvent organic.

Determinarea indicelui de ester (IE)

Indicele de ester (IE) reprezinta cantitatea de KOH (mg) necesara pentru saponificarea esterilor continuti intr-un g grasime. Pentru determinarea indicelui de ester este necesara determinarea prealabila a indicilor de aciditate (IA) si de saponificare (IS) a probei.

Indicele de ester se calculeaza cu formula:     IE = IS - IA

Determinarea spectrofotometrica a fosfatidelor

Metoda se poate aplica in cazul uleiurilor vegetale brute si rafinate, conform STAS 145/14-78.

Determinarea continutului de fosfatide determinate ca echivalent P s-a facut cu spectofotometrul in UV - Viz SQ - 800, citirea facandu-se la λ=660 nm.

Reactivi:

31    acid clorhidric p.a., d = 1,19 - 25%

oxid de zinc p.a.

acid sulfuric p.a. (d=1,84)

molibdat de sodiu p.a. solutie; se adauga cu atentie 140 cm³ H₂SO₄ (d=1,84) peste 300 cm³ apa distilata. In solutia obtinuta si racita pana la temperatura camerei se introduc 12,5g molibdat de sodiu. Dupa dizolvarea molibdatului de sodiu, volumul solutiei se aduce la semn cu apa, intr-un balon cotat de 500 cm³. Dupa omogenizare, solutia trebuie lasata in repaus cel putin 24 ore inainte de utilizare.

Sulfat de hidrazina solutie 0,015%; se dizolva 0,150 g sulfat de hidrazina p.a. si se aduce la 1000 cm³ cu apa distilata.

Solutie etalon de fosfor:

solutie etalon de baza (solutia A); se dizolva 1,0984g fosfat monopotasic (KH₂PO₄) uscat 2 ore la 101⁰C, in apa distilata. Solutia se aduce la un volum de 250 cm³, intr-un balon cotat si se omogenizeaza; 1 cm³ solutie A contine 1000 μg fosfor.

solutie etalon de lucru (solutie B); se pipeteaza 5 cm³ solutie A intr-un balon cotat de 500 cm³ si se aduce la semn cu apa distilata; 1 cm³ solutie B contine 10 μg fosfor.

Se cantaresc 3-6 g proba cu precizie de 0,001g intr-o capsula de portelan sau platina. Se adauga cate 0,5g oxid de zinc pentru fiecare cantitate de 3g ulei, luata in lucru. Se plaseaza capsula pe un resou electric sau pe o flacara mica si se incalzeste lent pana cand proba devine vascoasa; se ridica apoi progresiv temperatura pana cand proba este complet calcinata (se va evita aprinderea probei).

Capsula se introduce apoi intr-un cuptor de calcinare unde se tine timp de 2 ore la 550-600⁰C. Se scoate capsula din cuptor si se raceste la temperatura camerei.

Peste cenusa racita se adauga 5cm³ apa distilata si 5cm³ acid clorhidric. Se acopera cu o sticla de ceas si se incalzeste continutul, la fierbere lenta, timp de 5 minute.

Se filtreaza continutul capsulei in hartie de filtru intr-un balon cotat de 100cm³. Se spala apoi capsula in doua - trei reprize cu putina apa distilata fierbinte, apele de spalare fiind trecute prin hartie de filtru in balonul cotat. In final se spala si hartia de filtru cu un jet de apa distilata fierbinte.

Dupa racire la temperatura camerei, filtratul se neutralizeaza cu solutie de hidroxid de potasiu, adaugata picatura cu picatura, pana la aparitia unei slabe turbiditati. Se adauga apoi acid clorhidric, picatura cu picatura, pana la dizolvarea precipitatului, adaugand in exces 2 picaturi.

In continuare se procedeaza in mod direct, in functie de natura uleiului supus analizei:

pentru uleiurile rafinate, solutia obtinuta ca mai sus serveste in continuare la efectuarea reactiei colorimetrice;

pentru uleiurile brute, solutia rezultata mai sus este adusa la semn cu apa distilata, la balonul cotat de 100 cm³. Dupa omogenizare, se pipeteaza 10 cm³ (V) in aceasta solutie intr-un balon cotat de 100 cm³, care va servi in continuare la efectuarea reactiei de culoare.

Solutiile obtinute fie pentru uleiurile brute, fie pentru uleiurile rafinate sunt tratate succesiv cu 8cm³ solutie de sulfat de hidrazina si 2cm³ solutie de molibdat de sodiu.

Dupa omogenizare, balonul este introdus intr-o baie de apa in fierbere, unde este mentinut (10+ 0,5) minute pentru developarea culorii.

Se scoate balonul din baia de apa si dupa racire la (20+0,5)⁰C prin introducerea in apa rece, se aduce la semn cu apa distilata, dupa care continutul se omogenizeaza prin rasturnarea balonului de cateva ori.

Concomitent cu proba de analizat si absolut in aceleasi conditii, se efectueaza o proba martor continand toti reactivii, dar fara ulei.

Din valoarea extinctiei probei de analizat, se scoate valoarea E probei martor (apa). Se citeste de pe curba de etalonare continutul de fosfor (P) corespunzator extinctiei rezultate.

Valoarea E etalonului O se scoate din valoarea extinctiei celorlalte etaloane, iar cu valoarea obtinuta se traseaza curba de etalonare.

Cantitatea de P din proba in procente se calculeaza cu relatia:

(%)

in care: c = continutul de fosfor citit de pe curba, (μg)

m = masa probei luata in lucru (g)

Continutul de fosfatide din proba se determina luand in calcul fosfatida care contine amino-alcoolul colina (lecitina), iar acizii grasi superiori cu care a fost esterificata glicerina: acid oleic si linoleic.

fosfatide (%) = 780/31 P

in care: P = continutul de P al probei (%)

780 = masa unui mol de lecitina

31 = masa fosforului

2.2. Determinari in vivo de eficienta dermo-cosmetologica

Studiul dermato-cosmetic a fost realizat in laboratorul de Dermatofarmacie si Cosmetologie a Facultatii de Farmacie Timisoara, in perioada februarie - iunie 2011.

Efectul antiaging a fost studiat in vivo, pe voluntari sanatosi, prin inregistrarea involutiei ridurilor fine cu Proderm Analyser. Aparatul realizeaza fotografii digitale ale unei arii cutanate de 1mm², fotografii care sunt transformate de soft-ul aparatului in harti de riduri, colorate in albastru.

Am admis in studiu 24 de voluntari de sex feminin, cu virste cuprinse intre 33 si 59 de ani.

Zonele cutanate de fotoimbatranire (in principal regiunea externa a antebratului) se remarca prin riduri fine (fig 34).

Zonele cutanate de cronoimbatranire au ca regiune caracteristica zona ochilor (figura 35).

Fig 34. Riduiri fine inregistrate in regiunea externa a antebratului (zona caracteristica pentru fenomenul de fotoimbatranire), la un voluntar de sex feminin de 33 ani, la inrolarea in studiu

Fig. 3 Riduiri periorbitare, tipice pentru fenomenul de cronoimbatranire, la un voluntar de sex feminin de 45 de ani, la inrolarea in studiu

Criteriile de admisie a voluntarilor in studiu. Am admis voluntari sanatosi, avand peste 18 ani, prezentand semne de imbatranire cutanata fotoindusa sau cronologic indusa, observate clinic sau doar imagistic cu Proderm Analyser, si fara alte semne de dermatoze (leziuni de acne, seboree, leziuni psoriazice).

Voluntarii au fost tratati pe zonele foto- sau crono-imbatranite cu uleiul de Oenothera biennis, 1 aplicare / zi.

Evaluarile imagistice au fost inregistrate dupa 14 zile, 21 zile si respectiv 28 de zile de la initierea experimentului.

3. Rezultate si discutii

3.1. Rezultatele determinarilor fizico-chimice

Valorile experimentale obtinute la analiza indicilor fizico-chimici a uleiurilor de Oenothera biennis sunt prezentate in tabelul nr

Tabelul nr  Rezultatele determinarilor fizico-chimice pentru probele de ulei de Oenothera biennis

3.2. Rezultatele testarilor dermato-cosmetice

Dupa primele 14 zile de aplicare cutanata a uleiului de Oenothera biennis am inregistrat pentru toti membrii grupului o imbunatatire a texturii pielii (observata clinic), un aspect luminos, dar nu au fost remarcate modificari obiective inregistrate cu ProDerm Analyzer. Acest rezultat nu este surpinzator, pentru ca sinteza colaganului de catre fibroblast este un process care reclama timp.

Dupa 21 zile de tratament cu ulei de Oenothera biennis am inregistrat, pentru majoritatea membrilor grupului (17 din 24) un declin important al semnelor de fotoimbatranire, dar nu au existat ameliorari ale semnelor de cronoimbatranire - fig. 36.

Fig 36. Regresie a ridurilor (imagini anterioare de tratament si la finele tratamentului), pentru un voluntar de 38 de ani, de sex feminin, dupa 21 zile de tratament

Dupa 28 de zile de aplicare cotidiana am inregistrat pentru majoritatea membrilor grupului o imbunatatire majora a reliefului cutanat (scaderea densitatii de riduri) doar pentru ariile cutanate fotoimbatranite, si nu am observat ameliorari semnificative ale ariilor cronologic imbatranite.

Pentru aceasta diferenta relevanta de evolutie a ridurilor lansam doua ipoteze:

Ariile fotoimbatranite au fost prezente si la voluntari tineri, ca urmare a expunerii excesive a acestora la UV. Organismele tinere au insa o rata mai rapida a resintezei colagenului, sub tratament [44].

Ridurile induse cronologic sunt continuu intretinute, chiar sub tratament regenerator pentru colagen, pentru ca la producerea lor contribuie in permanenta muschii involuntari ai mimicii. Din acest motiv, cosmetologia moderna cauta alternative la injectia cu botox (ex. argirelina), pentru a inhiba musculatura mimicii.

Figura 37 prezinta o involutie impresionanta a ridurilor fotoinduse, la un voluntar in virsta de 28 de ani, dupa aplicarea uleiului de Oenothera biennis, timp de 28 de zile.

Fig 37. Regresie a ridurilor fotoinduse, pe o regiune expusa la soare (partea externa a antebratului), dupa 28 de zile de trament, la un voluntar de 34 de ani

Textura pielii pe timpul experimentului

La momentul inrolarii voluntarilor in studiu am inregistrat o deshidratare cutanata importanta la un mic numar de subiecti, fapt observat prin analiza parametrului textura pielii a aparatului (cadrilaj tegumentar solzos). La finele experimentului, dupa cele 28 de zile, toate inregistrarile relevau o textura normala. - figura 38.

Figura 38. Imagini de textura a pielii, inainte si la finele tratamentului, la o pacienta in virsta de 52 de ani. Se remarca disparitia cadrilajului tegumentar de tip solzos.

Pentru aceasta evidenta ameliorare de textura a suprafetei cutanate, putem presupune ca a avut loc o hidratare epidermala, la care ar fi contribuit doua procese:

uleiul de Oenothera biennis a actionat ca un film de suprafata, care se opune pierderilor de apa trandermica,

Oenothera biennis, prin bogatia de acizi grasi polinesaturati poate fi o sursa importanta de ceramide epidermale, stiut fiind faptul ca acizii grasi nesaturati aditioneaza la sfingosina pentru a forma ceramidele [43].

4. Concluzii

Industria cosmetica beneficiaza de numeroase surse vegetale, folosite fie ca extracte, fie ca molecule pure identificate, atat pentru tratarea unor dermatoze, cat si ca ingredienti cosmetici, din cel putin doua motive:

laboratoarele de productie dar si consumatorii gasesc a fi mai complante si mai agreate extractele vegetale. In mentalul colectiv ele nu sunt toxice, in ciuda faptului ca exista reale dovezi de toxicitate si pentru unele molecule sintetizate de regnul vegetal,

moleculele de origine animala au fost de-a lungul timpului controversate datorita unor boli specifice regnului animal (boala vacii nebune, gripa aviara etc).

Industria cosmetica moderna se axeaza predominant pe extracte vegetale (regeneratori epidermali - ex. algele cyanophyte, stimulatori de colagen - ex. beta-glucanul din cereale, seboreducatoare - ex. extractul palmierului Saw palmetto, etc), iar Oenothera biennis este doar o fateta a ansamblului de reglatori ai sintezei de colagen dermic.

Studiul de fata a relevat pe de o parte calitati fizico-chimice in acord cu literatura de specialitate pentru uleiul de Oenothera biennis obtinut prin presare la rece, iar pe de alta parte o activitate antiaging pentru uleiul de Oenothera biennis, demonstrata in vivo, printr-o metoda de imagistica cutanata, pentru imbatranirea fotoindusa, ceea ce concorda cu unele date din literatura de specialitate.

Bibliografie

1.     Hywel C Williams. Evening primrose oil for atopic dermatitis. British Medical Journal, 2003; 327:1358-1359.

2.     Darlington,L. Gail ; Stone, Trevor W. 2001. Antioxidants and fatty acids in the amelioration of rheumatoid arthritis and related disorders. British Journal of Nutrition 85, no. 3, Supplement 1, 2001: 251-269.

3.     Chiara Dalla Pellegrina, Giorgia Padovani, Federica Mainente, Gianni Zoccatelli, Gaetano Bissoli, Silvia Mosconi, Gianluca Veneri, Angelo Peruffo, Giancarlo Andrighetto, Corrado Rizzi, Roberto Chignola. Anti-tumour potential of a gallic acid-containing phenolic fraction from Oenothera biennis, Cancer Letters 226 2005: 17-2

4.     Tsutomu Arimura, Akiko Kojima-Yuasa, David Opare Kennedy, Isao Matsui-Yuasa. Reactive oxygen species-independent G1 arrest induced by evening primrose extract in Ehrlich ascites tumor cells. Cancer Letters 207 (2004):19-2

5.     Celina Rocquet, Romain Reynaud, Laurent Sousselier. Innovative Global "Age-Defying" Strategy Cosmetic Science Technology, 2007: 119 - 12

6.     Wieland Peschel, Wilfried Dieckmann, Marlies Sonnenschein, Andreas Plescher - High antioxidant potential of pressing residues from evening primrose in comparison to other oilseed cakes and plant antioxidants. Industrial Crops and Products, 25 (2007): 44-54

7.     Gh. David, Simona Nita, Adrian Borcean, Oenothera biennis L in south-western Banat, Research Journal of Agricultural Science, 41 (2), 2009 : 513 - 517

8.     Zhou QX. Interaction between heavy metals and nitrogen fertilizers applied in soil- vegetable systems. Bull Environ Contam Toxicol 2003; 71(2): 338- 344.

9.     Wenzel WW, Bunkowski M, Puschenrerter M, Horak O. Rhizosphere characteristics of indigenously growing nickel hyperaccumulator and excluder plants on serpentine soil. Environ Pollut 2003; 123: 131- 138.

10.  Shuhe Wei, Qixing Zhou, Xin Wang, Identification of weed plants excluding the uptake of heavy metals, Environment International 31 (2005): 829 - 834

11.  Baker AJM. Accumulators and excluders - strategies in the response of plants to heavy metals. J Plant Nutr 1981;3: 643- 654.

12.  M. Hamburger, U. Riese, H. Graf, M.F. Melzig, S. Ciesielski, D. Baumann, K. Dittmann and C. Wegner, Constituents in evening primrose oil with radical scavenging, cyclooxygenase, and neutrophil elastase inhibitory activities, J. Agric. Food Chem. 50 (2002), pp. 5533-5538

13.  Hanczakowski and B. Szymczyk, The nutritive value of the residues remaining after oil extraction from seeds of evening primrose (Oenothera biennis L.), J. Sci. Food Agric. 63 (1993), pp. 375-376.

14.  A. Patrizi, I. Neri, C. Orlandi and V. Guerrini, Efficacy evaluation of Oenothera biennis oil in 57 patients with atopic dermatitis, Giornale Italiano di Dermatologia e Venereologia 129 (1994), pp. LIX-LXIII

15.  Hywel C Williams. Evening primrose oil for atopic dermatitis. British Medical Journal, (2003), 327:1358-1359.

16.  Calder PC, Zurier RB. Polyunsaturated fatty acids and rheumatoid arthritis. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 2001, 4(2): 115-121

17.  Hiroshi Kawashima,Yoshiko Toyoda-Ono, Yoshihide Suwa,Yoshinobu Kiso, Subchronic (13-week) oral toxicity study of γ-linolenic acid (GLA) oil in rats Food and Chemical Toxicology Volume 47, Issue 6, 2009 : 1280-1286

18.  Hanczakowski, P., Szymczyk, B., The nutritive value of the residues remaining after oil extraction from seeds of evening primrose (Oenothera biennis L.). J. Sci. Food Agric. (1993), 63: 375- 376.

19.  Birch, A.E., Fenner, G.P., Watkins, R., Boyd, L.C. Antioxidant properties of evening primrose seed extracts. J. Agric. Food Chem., (2001) : 49, 4502-4507.

20.  Izabela Hany, Halina Pienkowska, Alina Dudkowiak, Danuta Frackowiak, The photochemical stability of oil from Evening Primrose seeds, Dyes and Pigments (2006), 70 : 177-184

21.  Lewis and Piez, 1964 M.S. Lewis and K.A. Piez, The characterization of collagen from the skin of the dogfish shark, Squalus acanthias, The Journal of Biological Chemistry 239 (1964), pp. 3336-3340.

22.  Bracho and Harrd, G.E. Bracho and N.F. Harrd, Purification, characterization, and radiolabeling of lingcod (Ophiodon elongatus) skin Type I collagen, Journal of Food Biochemistry 19 (1995), pp. 285-297.

23.  Mizuta et al., S. Mizuta, J.-H. Hwang and R. Yoshinaka, Molecular species of collagen from wing muscle of skate (Raja kenojei), Food Chemistry 76 (2002), pp. 53-58.

24.  Mizuta et al., S. Mizuta, J.-H. Hwang and R. Yoshinaka, Molecular species of collagen in pectoral fin cartilage of skate (Raja kenojei), Food Chemistry 80 (2003), pp. 1-7.

25.  Yata et al., 2001 M. Yata, C. Yoshida, S. Fujisawa, S. Mizuta and R. Yoshinaka, Identification and characterization of molecular species of collagen in fish skin, Journal of Food Science 66 (2001), pp. 247-251

26.  Yoshimura et al. K. Yoshimura, M. Terashima, D. Hozan and K. Shirai, Preparation and dynamic viscoelasticity characterization of alkali-solubilized collagen from shark skin, The Journal of Agricultural and Food Chemistry 48 (2000), pp. 685-690.

27.  A.J. Bailey, R.G. Paul and L. Knott, Mechanisms of maturation and ageing of collagen, Mech Ageing Dev 106 (1998), pp. 1-56

28.  A.J. Bailey, Molecular mechanisms of ageing in connective tissues, Mech Ageing Dev 122 (2001), pp. 735-755

29.  A.R. Hipkiss, Accumulation of altered proteins and ageing: causes and effects, Exp Gerontol 41 (2006), pp. 464-473

30.  H. Corstjens, D. Dicanio, N. Muizzuddin, A. Neven, R. Sparacio and L. Declercq et al., Glycation associated skin autofluorescence and skin elasticity are related to chronological age and body mass index of healthy subjects, Exp Gerontol 43 (2008), pp. 663-667

31.  Y. Okano, H. Masaki and H. Sakurai, Dysfunction of dermal fibroblasts induced by advanced glycation end-products (AGEs) and the contribution of a nonspecific interaction with cell membrane and AGEs, J Dermatol Sci 29 (2002), pp. 171-180.

32.  Lijuan Zhang, Timothy J. Falla, Cosmeceuticals and peptides, Clinics in Dermatology (2009) 27, 485-494

33.  Paolo U. Giacomoni, Advancement in skin aging: the future cosmeceuticals, Clinics in Dermatology (2008) 26, 364-366

34.  L. Robert, J. Labat-Robert, A.-M. Robert. Physiologie du vieillissement cutané Pathologie Biologie xxx (2008) xxx-xxx in press

35.  G. Jenkins, Molecular mechanisms of skin ageing, Mech. Ageing Dev. 123 (2002): 801 - 810

36.  Marie-Claude Martini. Introduction à la dermatopharmacie et a la cosmétologie, Editura Lavoisier, 2 ^em edition, 2006 

37.  Dragomirescu Anca  Dermatofarmacie si cosmetologie, Editura Mirton, Timisoara, 2008.

38.  Eun Ju Kim, Xing-Ji Jin, Yeon Kyung Kim, In Kyung O, Ji Eun Kim, Chi-Hyun Park, Jin Ho Chung, UV decreases the synthesis of free fatty acids and triglycerides in the epidermis of human skin in vivo, contributing to development of skin photoaging. Journal of Dermatological Science 57 (2010), 19-26

39.  Bezuglov VV, Bolorov MY, Archarov AV - Bioactive Amides of Fatty acids, 1998, Biochemistry, 63, 22-30.

40.  Pompeia C, Lopez LR, Miyasaka CK, Procopio J, Sannamiya P, Curi R - Effect of fatty acids on leucocite function. Braz J Med Res. 2000, 33(11), 1255-1268.

41.  Mihele D, Darmanescu D, Georgescu S. R. Determinarea actiunii cicatrizante a amidelor acizilor grasi din uleiul de Oenothera biennis. DermatoVenerol. (Buc.), 2008, 53: 73-77

42.  Leslie Baumann. Cosmetic dermatology, Ed Mc Graw Hill, 2002:

43.  Feier Virgil. Dermato-venerologie. Editura Amarcord , 1998,

44.  Maier Nicolae. Patologie cutanata. Vol I, Casa cartii de Stiinta, 1999.