Spectrofotometria de absorbtie in ultraviolet si vizibil

I. Notiuni teoretice

In aceasta lucrare incercam sa prezentam aplicatiile spectro-fotometriei in ultraviolet si vizibil pentru substante in stare lichida, lichide pure, amestecuri si in special solutii. Spectrele urmarite sunt spectre moleculere electronice la care structura de rotatie nu mai apare iar cea de vibratie se manifesta numai in anumite cazuri printr-o structurare a benzilor de absorbtie care, in general, sunt largi si nerezolvate in linii.

Benzile de absorbtie din aceste domenii spectrale corespund tranzitiilor de pe nivelul electronic fndamental pe cele mai joase nivele electronice excitate, pentru care tranzitiile sunt permise conform legilor de selectie. In aceste conditii tranzitiile electronice implica cele mai mari variatii de energie, iar frecventele cuantelor absorbite se situeaza atat in domeniul vizibil cat si de ultraviolet al spectrului.

La aceste tranzitii electronice participa electronii unor anumite grupari structurale ale moleculelor numite cromofori. In cazul substan-telor organice asemenea grupari structurale sunt reprezentate de legatura simpla, dubla si tripla, gruparea bazica, etc.

Interactia cromoforilor intre ei sau cu alte grupari atomice provoaca importante modificari ale spectru1ui de absorbtie atribuit cromoforului singur. In aceste conditii pot apare urmatoarele efecte:

efectul batocromic - de deplasare a maximului de absorbtie spre lungimi de unda mai mari (deplasarea spre rosu),

efectul hipsocromic - de deplasare a maximului de absorbtie spre lungimi de unda mai mici (deplasarea spre albastru),

efectul hipercromic - de crestere a intensitatii de absorbtie,

efectul hipocromic - de descrestere a intensitatii de absorbtie.

Proprietatile de absorbtie ale mediului pot fi caracterizate prin marimile: absorbanta, trasmitanta, extinctie, coeficient de extinctie.

Legea Bouguer-Lambert exprima relatia cantitativa dintre inten-sitatea I, a luminii emergente, intensitatea I₀, a luminii incidente, grosimea x a substantei absorbante si natura substantei.

Figura 6.1. Reprezentarea grafica a legii Bouguer-Lambert

(X_1/2 - grosimea de injumatatire).

Expresia legii Bouguer-Lambert se poate scrie:

Prin definitie transmitanta (T), sau coeficientul de transmisie al unei substante este data de formula:

iar extinctia naturala E_n, este data de relatia:

unde k_n reprezinta coeficientul natural de extinctie. Se poate arata usor ca 0 E_n

Avantajul folosirii extinctiei este acela al proprietatii de aditivitate pe care o are aceasta marime: un amestec de mai multe solutii diluate avand extinctiile E₁,,E_n se comporta ca o singura solutie cu extinctia globala E, data de relatia:

Prin absorbanta (A), sau coeficient de absorbtie se intelege:

Referat: Vitaminele - surse alimentare de vitamine Referat: 41 de sfaturi pentru viata lunga recomandate de doctor

In practica, deoarece logaritmii naturali sunt mai putin comozi se foloseste o relatie asemanatoare in care intervin, insa logaritmii zecimali:

unde k reprezinta coeficientul zecimal de extinctie iar E extinctia zecimala sau densitatea optica.

Lege Beer - este valabila numai pentru solutii diluate si stabileste o legatura matematica intre extinctia E, concentratia C a substantei si coeficientul molar de extinctie care depinde de natura substantei si de lungimea de unda.

unde C se masoara in mol/dm³.

In aceste conditii legea Bouguer-Lambert-Beer se poate scrie:

Curbele care dau dependenta E=f(l), T=f(l), A=f(l e=f(l) sau f(n), sunt cunoscute sub numele de spectre de absorbtie.Un exemplu de astfel de spectru este reprezentat in figura 6.2.

Figura 6.2. Spectrul de absorbtie de tipul A=f(l

Factorii care pot influenta spectrul de absorbtie al unei substante:

a)     natura solventului - nivelele energetice electronice ale molecu-lelor in stare condensata pot fi modificate prin prezenta moleculelor solventului datorita interactiilor ce apar.

b)     concentratia solutiei si temperatura - cu cresterea concentratiei apar asocieri moleculare care dau un spectru distinct de cel al monomerului substantei de studiat, temperatura favorizeaza deplasarea echilibrului dintre concentratiile de monomer si dimer iar temperaturile ridicate pot produce chiar transformari ireversibile ale spectrelor de absorbtie.

c)      valoarea pH-ului solutiei - la valori diferite de pH, punctul izosbestic aparut in spectru indica prezenta in amestec a unor specii moleculaare ce se transforma una intr-alta intr-o proportie depinzand de pH.

d)     iradierea substantelor - iradierea optica a probei poate conduce la polimerizarea unei specii moleculare si de aici modificari in spectrul de absorbtie.

e)     formarea de complecsi - cationii prezenti in solvent pot duce la formarea complecsilor si deci influentarea spectrului probei.

f)      fluorescenta - datorita fenomenului de fluorescenta, intensitatea radiatiei reemise va duce la o valoare aparent mai mica a absorbtiei probei decat cea reala.

g)     fenomene de oxidare

h)     probele nu sunt dizolvate total sau precipita ulterior

i)       fenomene de hidroliza

Descrierea instalatiei spectrofotometrice

Un spectrofotometru contine o parte optica si una electrica. Componentele de baza ale partii optice sunt: sursa, monocromatorul, compartimentul probelor si detectorul impreuna cu sistemul de inregistrare (figura 6.3).

Figura 6.3. Principalele componente ale unui spectrofotometru.

Spectrofotometrele se pot clasifica atat dupa sistemul dispersiv cat si dupa sistemul constructiv. Astfel, in functie de primul criteriu exista spectrofotometre cu prisma, spectrofotometre cu retea, spectro-fotometre mixte, iar in functie de al doilea criteriu spectrofotometre cu monofascicul si cu dublu fascicul.

Spectrofotometrul Camspec M330 are ca element dispersiv o retea de difractie cu 1200 linii/mm si este de tipul monofascicul. M330 poate trasa spectre UV-VIS in intervalul de lungimi de unda cuprins intre 190-900nm, cu o acuratete de 1nm. In absorbtie poate balea pe intervalul -0.3 la 2.5Abs, iar in transmisie de la 0 la 200%. M330 poate fi accesat fie direct utilizand tastatura acestuia, fie prin intermediul unui calculator.

II. Parte experimentala

Trasarea spectrelor de absorbtie ale diferitelor tipuri de Hb

(A) Pentru obtinerea hemoglobinei

• se centrifugheaza sangele uman la 5000 rot/min
• se indeparteaza supernatantul
• se suspenda celulele rosii in tampon izoton 0.9% NaCl.
• se centrifugheaza 10 min la 5000 rot/min (supernatantul trebuie sa fie cat mai limpede)
• se lizeaza globulele rosii astfel: se adauga la un volum de eritrocite 1.5 volume de apa si 0.5 volume cloroform
• se indeparteaza cloroformul
• se foloseste solutia de hemoglobina pentru citire la spectro-fotometru.

(B) Pentru obtinerea methemoglobinei (de culoare bruna)

• se trateaza o parte din solutia de hemoglobina cu solutie de fericianura de potasiu 3%

(C) Pentru obtinerea hemoglobinei reduse

• se adauga la solutia initiala de hemoglobina ditionit de sodiu in exces pana la observarea culorii violete.

Mod de lucru O posibilitate simpla si rapida de trasare a unui spectru este utilizarea programului in varianta de lucru "Immediate mod". Acest mod permite scanarea probei intre doua lungimi de unda, marirea si micsorarea  unor zone prestabilite, deplasare cursorului in zonele dorite obtinandu-se valorile de absorbtie si de lungime de unda, afisarea datelor sub forma de tabel, derivatele 1-4 ale spectrului, salvare si printare a graficului.

Primul pas il constituie selectarea tipului de grafic dorit absorbtie sau transmisie; acest lucru facandu-se foarte usor prin selectarea cu ajutorul mouse-lui a butoanelor Abs sau %T.

Se selecteaza apoi Scan l pe ecran aparand o fereastra "Enter scan wavelengths" pentru selectarea intervalului de lungimi de unda. Dupa introducerea datelor se apasa OK. Se asteapta cateva secunde pana spectofotometrul isi atinge lungimea de unda de start. Fara proba in compartimentul cuvelor sau de preferat cu o cuva continand numai solventul in care a fost preparata solutia, se traseaza zeroul prin apasarea butonului Set Zero.

Dupa obtinerea zeroului si primirea mesajului de confirmare se trece la trasarea spectrului propriu-zis prin apasarea butonului Start. Folosind butonul ID se poate face o fisa de identitate a probei iar apasand butonul Disk graficul poate fi salvat pe disk in zona dorita. Butonul Data permite listarea valorilor obtinute, Zoom(+-) marire si micsorare a unor zone prestabilite iar Deriv trasarea derivatelor spectrului.

Se traseaza spectrele de absorbtie ale diferitelor tipuri de hemo-globina (A), (B), (C) preparate si se compara cu datele din literatura.

Figura 6.4. Spectrele de absorbtie ale diferitelor tipuri de hemoglobina.