Reactii de aglutinare

REACTII DE AGLUTINARE

Termenul de aglutinina este folosit pentru a descrie anticorpii care aglutineaza antigenele particulate, non-solubile. Anticorpii completi sunt cei de tip IgM care se leaga la determinantii antigenici ca pentamer si induc aglutinarea acestor antigene. Anticorpii incompleti sunt de tip IgG, se leaga la determinanti antigenici ai eritrocitelor dar nu pot determina aglutinarea. Cand antigenul utilizat este un eritrocit, vorbim despre reactii de hemaglutinare.Toti anticorpii pot teoretic sa aglutineze antigene particulate, dar datorita polivalentei, anticorpii de tip IgM reprezinta clasa cea mai eficienta de aglutinine. Pentru anticorpii de tip IgG este necesar un adjuvant de tipul albuminei in reactie, al carui rol este sa reduca distanta intre celulele rosii, permitand anticorpilor de tip IgG sa lege punti intre celule.

Aglutinarea este rezultatul formarii unei retele deAg si Ac intr-un numar suficient de mare care sa permita vizualizarea cu ochiul liber. Reactiile de aglutinare sunt sensibile, pot detecta cantitati mici de Ac. Nu sunt metode cantitative, procedand insa la efectuarea de dilutii, se poate insa realiza dozarea semicantitativa.

Clasificare teste de aglutinare:

1.     Teste directe sau active - particulele de reactie sunt purtatoare ale Ag specific (hematii, leucocite, trombocite, bacterii, toxoplasma, etc).

2.     Teste indirecte sau pasive - particule de reactie incarcate cu un determinant Ag artificial fixat pe suprafata particulei (hematii, particule latex, microcristale de colesterol).

Aglutinarea directa: particulele purtatoare ale determinantului Ag sunt puse in contact cu Ac specifici in mediu lichid salin. Ac se combina cu Ag si formeaza o retea de aglutinare. Reactia se poate desfasura in tuburi de reactie sau pe placi de sticla sau de opalin.

Aplicatii practice ale aglutinarii directe sunt:

o      Determinarea grupelor sanguine

o      Identificarea aglutininelor la rece la 4⁰

o      Diagnosticul mononucleozei infectioase

o      Diagnosticul salmonelozei

Aglutinarea indirecta: Ag solubil este fixat pe particule variabile, suspensia de particule este pusa in contact cu serul de cercetat la fel ca in cazul aglutinarii directe.

Aplicatii practice:

o      Diagnosticul sifilisului - Ag cardiolipidic fixat pe microcristale de colesterol in suspensie coloidala - reactie pe lama.

o      Diagnosticul sifilisului prin testul de hemaglutinare a Treponemei pallidum (TPHA) - Ag treponemic este fixat pe hematii

o      Diagnosticul tiroiditei autoimune- Ac anti-tiroglobulina: tiroglobulina este fixata pe hematii

o      Identificare factor reumatoid - IgG sau IgM modificati; reactia Waaler-Rose sau latex-aglutinarea

Referat: Vitaminele - surse alimentare de vitamine Referat: 41 de sfaturi pentru viata lunga recomandate de doctor

Aglutinarea artificiala - consta in utilizarea unui artificiu tehnic pt a provoca aglutinarea (cel mai adesea directa) a Ag particulate, de catre Ac ce nu pot aglutina spontan.

o      Utilizarea de medii macromoleculare - albumina bovina, ser uman sau dextran.

o      Incubarea hematiilor cu enzime proteolitice

o      Adugarea unei antiglobuline - test Coombs

Aglutinarea inversa - identificare antigene si nu anticorpi - Ac specifici sunt fixati pe hematii.

Teste calitative de aglutinare sunt utilizate in demonstrarea prezentei unui Ac sau a unui Ag. Anticorpii sunt mixati cu antigenele particulate si un test pozitiv este indicat de aglutinarea Ag particulat.  

De exemplu se pot mixa eritrocitele unui pacient cu anticorpi in scopul determinarii grupei sanguine sau se amesteca Er cu grupa cunoscuta cu serul unui pacient primitor pentru a determina prezenta sau nu de Ac anti - Er in serul acestuia.

Teste cantitative de aglutinare utilizate pentru a masura nivelul de Ag particulate. In acest tip de teste se fac dilutii seriale pe o proba si apoi se adauga un numar fix de Er sau bacterii sau alte Ag particulate. Dilutia maxima ce produce aglutinare vizibila constituie valoare titru.In figura de mai jos, test de hemaglutinare cantitativa.

Ocazional, daca este mare concentratia de Ac (dilutii joase), nu apare aglutinare apoi daca proba este diluata, apare aglutinarea (vezi pacientul 6 in schema de mai sus). Lipsa aglutinarii la concentratii mari de Ac poarta numele de efect prozone.  Lipsa aglutinarii la concentratii mari se datoreaza excesului de Ac care determina formarea de complexe mici care nu se aglomereaza in aglutinate.

Aplicatii ale testului de aglutinare:

a.     Determinarea grupelor sanguine

Hemaglutinarea este de rutina folosita pentru tiparea grupelor sanguine - mixare Er pe lamela cu Ac anti_A sau anti_B si daca Ag este prezent, apare aglutinare pe lama.

b.     Investigarea infectiilor bacteriene - de exemplu, cresterea de 4 ori a titrului de Ac fata de o bacterie anume este considerate titru semnificativ si indica o infectie cu acel tip de bacteria.

Aglutinarea bacteriana - este folosita pentru depistarea de Ac anti bacterieni in diagnosticul infectiei. Prezenta antigenelor bacteriene in organism determina raspuns de tip imunoglobuline specific. Punerea in contact a serului pacientului cu dilutii seriale de Ag bacteriene al presupusei infectii, determina prezenta sau nu a Ac in serul de cercetat

Aspecte practice - desi testul este usor de facut, este numai semicantitativ.

Hemaglutinarea pasiva

Testul de aglutinare lucreaza numai cu Ag particulate. Cu toate acestea, este posibila acoperirea Er cu un Ag solubil (ex: viral, polizaharid, haptena) si apoi sa se foloseasca Er acoperite de Ag solubil pentru a testa/determina prezenta de Ac specifici, anti-antigen solubil (vezi figura de mai jos). Acest test se numeste hemaglutinare pasiva, se lucreaza exact ca testele de aglutinare. Este util pentru detectia Ac anti-Ag solubile si pt detectia Ac anti-virali.

De-a lungul anilor s-a trecut de la Er la utilizarea unor particule sintetice cum ar fi particulele de latex.

Aglutinarea cu latex - anticorpii sunt atasati pe support de latex ce serveste ca marker pentru detctarea reactiei Ag-Ac. Fiecare particula de latex cu dimensiune de aproximativ 1 micron, poate fi incarcata cu mii de molecule de Ac. Particulele de latex-Ac formeaza o suspensie laptoasa si in contact cu proba de cercetat ce contine antigenul cautat, se formeaza agregate vizibile de complexe Ag-Ac. Figura de mai jos ilustreaza evenimentele asociate reactiei de aglutinare associate cu particulele de latex.

Latex aglutinarea se face de obicei pe lame de sticla sau pe suprafete de carton special tratate, utilizand volume mici de particule de latex si serul de cercetat. In laboratoarele clinice testul este folosit pentru detectarea de Ag microbiene solubile direct in ser sau lichidul cefalorahidian sau pentru identificarea unor Ag bacteriene din culturi.

Metodele sunt atractive prin rapiditate si sensibilitate, putand detecta nivele de Ag de ordinal nanogramelor/ml.

. Testul antiglobulinic - testul Coomb's

1. Testul Coomb's direct - Cand Ac se leaga la Er nu determina intotdeauna aglutinare datorita excesului de Ag sau de Ac sau in cazul modificarilor electrice la nivelul Er ce impiedica reactiile de linkare. Acesti Ac care se leaga la Er dar nu determina aglutinare se numesc Ac incompleti - definitie functionala si nu una care sa sugereze structura diferita a Ac. Pt a fi detectati Ac non-aglutinanti de pe suprafata Er se adauga un al doilea Ac indreptat impotriva Ac de pe Er. Acest Ac anti-imunoglobulina poate cross-linka  Er si determina aglutinarea = test Coomb's direct.

2. Testul Coomb's indirect - detecteaza prezenta de Ac antir-Er prezenti in ser. Presupune incubarea Er cu probe de ser, spalarea lor pt indepartarea Ac nelegati si apoi adaugarea unui al doilea Ac anti-imunoglobulina care va depista Ac legati pe suprafata Er si va cross-linka celulele.

Aplicatii practice - detectarea Ac anti - Rh - in general Ac anti-Rh nu aglutineaza Er. Astfel Er copilului cu Rh+ nascut din mama Rh- care are Ac anti-Rh, pot fi acoperite cu acesti Ac. Pt a verifica se face un test Coomb's direct. Pt a verifica prezenta Ac anti-Rh in sangele mamei se face testul Coomb's indirect.

Inhibitia hemaglutinarii

Testul de aglutinare poate fi modificat pt a fi folosit la masurarea Ag solubile. Acest test este numit test de inhibitie a hemaglutinarii - masoara capacitatea unui Ag solubil de a inhiba aglutinarea unor Er acoperite cu Ag de catre Ac. In acest test, o cantitate fixa de Ac fata de un Ag este amestecata cu o cantitate fixa de Er acoperite cu Ag. Se adauga cantitati variabile din serul de cercetat care este investigat pt detectarea prezentei Ag. Daca proba contine Ag, Ag solubil va competitiona cu Ag de pe suprafata Er impiedicand aglutinarea.

Prin dilutii seriate se masoara cantitatea de Ag in proba necunoscuta prin titrare. Cuantifica in general Ag solubile. Metoda este larg utilizata in clinica pentru a determina daca un pacient a fost expus la o anumita infectie virala (ex: rubeola) sau nu sau pentru teste de sarcina (HCG, Ac anti HCG). Daca serul pacientului contine Ac anti-virali, acestia vor interactiona cu ag viral si inhiba hemaglutinarea.

Aplicatii practice:

Dg serologic boli infectioase: febra tifoida, salmonella, Brucella

Determinare Ac specifici tisulari in BAI

Detectarea prezentei epitopilor antigenic pe celule

Tipizarea sangelui

Dg infectiilor virale; aglutinarea bacteriana