Utilizarea turbei pentru depoluarea solurilor contaminate cu produse petroliere

1. Notiuni generale despre turba

Turba se gaseste in natura ca formatiune sedimentara autohtona, formata din diferite resturi de plante apartinand zonelor umede, si care se afla in diferite grade de conservare. Turbariile sunt raspandite in tara noastra in zonele umede, mai ales in zona muntoasa si deluroasa a Carpatilor.

In raport cu conditiile de formare se deosebesc trei tipuri de turbarii:

turbarii de mlastini eutrofe – acest tip de turba este de culoare foarte inchisa aproape neagra, este mai compacta, cu o structura usor prafoasa si un continut ridicat de humus, fata de turbele oligotrofe.

turbarii de mlastini oligotrofe – se formeaza pe orice forma de relief, de obicei sub paduri. Aceasta turba este mai saraca in elemente nutritive. Aceasta turba are o structura fibroasa de unde rezulta o porozitate ridicata (~80%). Uscata are o culoare brun-rosiatica.

turbarii de mlastini intermediare sau mezotrofe

Compozitia turbei este foarte complexa si depinde in general de materialul initial, de conditiile locale, geologice, climatice, biotice, care influenteaza procesele din zacamant. Turba are un continut ridicat de materie organica, aceasta fiind alcatuita din substante organice nehumice (carbohidrati, proteine, peptide, aminoacizi, etc) si substante organice humice (acizi humici si fluvici). Literatura de specialitate confirma ca particulele de humus coloidal retin la suprafata lor si substante organice nepolare (sorbtie moleculara sau apolara).

Datorita avantajului ca este biodegradabila, turba saturata cu produs petrolier poate fi tratata prin biodegradare (compostare, land-farming), reducandu-se astfel periculozitatea si costurile asociate cu masurile de depozitare corespunzatoare. Astfel, aceasta tehnica se dovedeste a fi o alternativa economica de depoluare, in comparatie cu tehnologiile de baza existente.

Prin aceasta metoda sorbentul se imprastie pe zona afectata, in functie de adancimea si marimea ariei poluate, avand proprietatea de a incapsula produsele petroliere (functie de gradul de hidrofobicitate). Aceasta este atat o metoda de prevenire a migrarii poluantilor in subteran, cat si o metoda de tratare, prin “incapsularea” produselor petroliere in sorbent si apoi biodegradarea acestuia prin metoda land-farming, realizandu-se in final integrarea completa a turbei si a contaminantilor absorbiti, in sol.

Pentru a spori capacitatea de adsorbtie a produselor petroliere s-au aplicat procedee de deshidratare termica in conditii aerobe in vederea cresterii hidrofobicitatii, si prin aceasta realizarea unui randament superior de “incapsulare” a poluantilor.

De asemenea, aceasta turba va constitui suportul pentru insamantarea cu microorganisme specifice, capabile sa biodegradeze produsele petroliere. In acest sens, a fost necesar sa se studieze microorganismele existente atat in compozitia turbei cat si cele existente in solurile contaminate cu produse petroliere.

In concluzie, rolul turbei ca material absorbant in procesul de depoluare este bine determinat:

In cele doua etape ale proiectului s-au realizat urmatoarele obiective:

evaluarea si caracterizarea fizico-chimica si microbiologica a turbei indigene;

testarea capacitatii de sorbtie a sorbentilor folositi (naturali si artificiali);

evaluarea si caracterizarea microbiologica a solurilor contaminate cu produse petroliere;

caracterizarea produselor petroliere utilizate drept poluanti in procesul de depoluare.

studiul procesului de absorbtie si biodegradare a hidrocarburilor petroliere in interiorul turbei si a solului contaminat;

modelarea si optimizarea proceselor studiate;

evaluarea impactului asupra mediului, a procedeelor de decontaminare a solului cu continut de hidrocarburi petroliere.

2. Caracterizarea fizico-chimica a turbei de Suceava

In studiu s-a luat turba din arealul judetului Suceava, care prezinta urmatoarele caracteristici:

este un produs 100% natural, fiind biodegradabil;

compozitie: muschi de turba (Sphagnum sphagnum) +/- 90% si apa +/- 10%;

nu este solubila in apa;

este un produs solid, rezultat din descompunerea muschiului de turba;

are un aspect fibros, cu celule mari, de unde rezulta o porozitate ridicata (~80%) ceea ce ii confera a capacitate mare de sorbtie pentru lichide;

culoare brun-roscata in stare uscata si o culoare brun spre negru in stare umeda;

continut ridicat de acizi humici, care pot sustine activitatea microbiologica in procesul de biodegradare a produselor petroliere;

lipsit de toxicitate pentru mediu.

Tabel 1. Caracteristici fizico-chimice ale turbei

* compozitia chimica in procente la substanta uscata.

Deoarece in stare initiala-naturala turba este un material hidrofil, avand o capacitate ridicata de retentie a apei, s-a urmarit a imprima turbei unui caracter hidrofob, prin uscare termica in conditii aerobe. In studiile efectuate am folosit aceasta turba modificata termic.

Caracteristicile turbei modificate termic sunt prezentate in tabelul 2.

Tabelul 2. Caracteristicile turbei modificate termic

* compozitia chimica in procente, raportata la substanta uscata.

3 Metode de testare si rezultate

A. Caracterizarea produselor petroliere folosite

Pentru studiul depoluarii solurilor contaminate cu hidrocarburi petroliere, s-a avut in vedere tipurile de hidrocarburi cel mai des utilizate. Astfel s-au luat in studiu: benzina, motorina, CLU (combustibil) si titeiul.

Vascozitatea produselor petroliere au fost masurate cu ajutorul vascozimetrului Engler. Densitatea acestor produse a fost determinata cu ajutorul picnometrului. Determinarile sunt media a trei probe, la 20 C.

Tabelul 3. Valorile vascozitatii si densitatii pentru fractiunile petroliere analizate

Determinarea vascozitatii produselor petroliere

Vascozitatea este o proprietate fizica a fluidelor care exprima rezistenta opusa de fluid (la curgere), datorita frecarii interne cand straturile sale adiacente se deplaseaza unele fata de altele.

Un fluid oarecare poate fi caracterizat cu ajutorul urmatoarelor tipuri de vascozitati:

vascozitate dinamica sau absoluta, h

Lucrare: Proiect didactic Muntii Carpati - geografia Romaniei Referat: Comuna Cotnari - istoric

vascozitate relativa, m

vascozitate cinematica, n

vascozitate conventionala: Engler, Saybolt, Redwood.

Vascozitatea dinamica sau absoluta, h, se defineste cu ajutorul relatiei:

unde: F - forta care deplaseaza lichidul, dyne;

S - suprafata stratului, cm²;

d - distanta dintre doua straturi adiacente, cm;

Dv - gradientul de viteza, cm/s.

Daca in relatia de mai sus Dv = 1, S = 1 cm² si d = 1 cm, atunci h = F , adica vascozitatea dinamica reprezinta forta de rezistenta pe care trebuie sa o invinga doua straturi adiacente de lichid cu suprafata de 1cm², aflate la distanta de 1 cm unul fata de celalalt, cand se deplaseaza reciproc cu viteza de 1 cm/s. Daca forta care deplaseaza straturile de lichid este F=1 dyne, atunci vascozitatea acelui lichid este egala cu unitatea si se numeste poise, P. In practica se utilizeaza submultiplul numit centipoise, cP(1P=100 cP).

Vascozitatea relativa, m, reprezinta raportul dintre vascozitatea dinamica a lichidului de cercetat si vascozitatea dinamica a unui lichid de referinta, de regula apa a carei vascozitate la 0⁰C este 1,792.

m h_lichid h_apa h_lichid

Vascozitatea relativa este o marime adimensionala.

Vascozitatea cinematica, n, reprezinta raportul dintre vascozitatea dinamica si densitatea lichidului determinate la aceeasi temperatura.

n h_lichid r_lichid

Unitatea de masura a vascozitatii cinematice este stokes-ul (St) care reprezinta vascozitatea unui lichid a carui densitate este de 1 g/cm³. ~n practica se foloseste multiplul, centistokes (cSt).

1 St = 100 cSt sau 1 cSt = 10^-2 St

Vascozitatea conventionala se exprima cel mai des sub forma vascozitatii conventionale Engler avand ca masura gradul Engler, ⁰E. Vascozitatea Engler reprezinta raportul dintre timpul de scurgere a unui volum de 200 ml lichid, la o anumita temperatura si timpul de scurgere a aceluiasi volum de apa distilata la 20⁰C, prin orificiul calibrat al vascozimetrului Engler.

Vascozitatea lichidelor depinde de temperatura scazand cu cresterea temperaturii. Acest lucru este deosebit de important in cazul uleiurilor de uns, care prin cresterea fluiditatii isi pierd proprietatile de ungere.

Reactivi. Aparatura

fractiune petroliera

vascozimetru Engler

Vascozimetrul Engler este prezentat in figura 1.

Figura 1. Vascozimetrul Engler

Vascozimetrul Engler se compune dintr-un vas metalic (1) prevazut cu capac (2) si un tub de scurgere pe la partea inferioara (3). Capacul are doua orificii: unul pentru tija (4) care inchide orificiul de scurgere, iar celalalt pentru un termometru (5) cu care se citeste temperatura in timpul experientei. Vasul (1) este introdus intr-o baie metalica (6), sprijinita pe un stativ in care se gaseste apa, termostatul (7) si agitatorul manual (8). In vasul (1) se afla trei repere (stifturi) (9) care indica nivelul pana la care trebuie sa fie lichidul de cercetat. Scurgerea lichidului are loc intr-un vas special (10) care contine doua volume marcate, unul de 100 ml si altul de 200 ml. Pentru masurarea timpului de scurgere se foloseste un cronometru.

Mod de lucru

Se spala cu benzina vasul metalic (1), se usuca in curent de aer, se spala din nou cu alcool etilic sau eter etilic si se usuca bine. Se introduce cu atentie produsul de cercetat in vasul (1) pana la nivelul reperelor.

Se introduce in baia metalica (6) apa sau glicerina care se incalzeste la o temperatura care depaseste cu 1-2⁰C temperatura determinarii. Se asteapta circa 5-10 minute pentru omogenizarea temperaturii celor doua lichide, timp in care se agita manual cu agitatorul. Se aseaza sub orificiul de scurgere (3) vasul de masurare (10). Apoi se ridica tija (4) si concomitent se deschide cronometrul. Se cronometreaza timpul corespunzator scurgerii a 200 ml fractiune petroliera. Se repeta experienta in aceleasi conditii pentru apa distilata, obtinandu-se astfel constanta aparatului, t_apa (sec.).

Vascozitatea Engler se calculeaza cu relatia:

c_E = t_lichid / t_apa

unde: t_lichid - timpul de scurgere a 200 ml lichid de cercetat;

t_apa - timpul de scurgere a 200 ml apa distilata la 20⁰C.

Variatia vascozitatii cu temperatura in graficul de coordonate sunt: in ordonata - vascozitatea in ⁰E si in abscisa - temperatura de lucru in ⁰C.

Determinarea densitatii lichidelor petroliere

Metodele cele mai utilizate pentru determinarea densitatii lichidelor sunt:

1). metoda plutitorilor liberi (areometre sau densimetre);

2). metoda picnometrului;

3). metoda cantaririi hidrostatice (cu balanta Mohr-Westphal).

Metoda picnometrului

Se bazeaza pe determinarea masei unui volum exact masurat de lichid. Se folosesc picnometre de diferite constructii, cu si fara termometru. In loc de picnometru se poate folosi un balon cotat cu capacitate mica (25 - 50 ml).

Se spala si se usuca bine picnometrul si se intareste la balanta analitica. Se noteaza masa picnometrului gol, m₀. Se umple picnometrul cu apa distilata, astfel incat sa nu ramana bule de aer in el (balonul cotat se aduce la semn) si se cantareste. Se noteaza masa picnometrului cu apa, m_a. Se goleste picnometrul de apa, se clateste de 2-3 ori cu portii mici din lichidul a carei densitate se determina si se umple cu lichid (la fel ca si cu apa). Se cantareste picnometrul cu lichid si se noteaza masa, m_x.

Se calculeaza densitatea relativa, r_r , (V_lichid = V_apa):

r_r r_lichid r_apa = m_lichid/m_apa = (m_x - m₀)/(m_a - m₀)

si apoi se calculeaza densitatea lichidului:

r_lichid r_r r_apa

Densitatea apei la diferite temperaturi (g/ml) este data in tabelul 4.

Tabelul 4. Variatia densitatii apei functie de temperatura

Valorile din tabel se iau corespunzatoare temperaturii camerei.

B. Testarea capacitatii de sorbtie a sorbentilor

S-au realizat teste pe sorbenti de tip II adsorbanti naturali – turba rumegus de stejar, rumegus de fag.

Un prim obiectiv al cercetarii a constat in studierea fenomenului de retinere a hidrocarburilor petroliere si estimarea capacitatii de retentie a acestor sorbenti. Acest test de sorbtie este efectuat pentru a determina cantitatea de lichid absorbit pe cantitatea de sorbent – g produs petrolier / g sorbent.

Tabelul Capacitatea specifica de retentie a produselor petroliere pe diversi sorbenti (naturali si sintetici), t=20-25 C

In figura 2 se compara capacitatea specifica de sorbtie a turbei cu capacitatile de sorbtie a unor sorbenti utilizati in mod curent pentru sorbtia lichidelor petroliere (T = 25⁰C, timp = 15 min).

Conform rezultatelor din figura 2 turba reprezinta cel mai bun sorbent de tip – II, gratie capacitatii superioare de sorbtie a lichidelor petroliere.

Figura 2. Compararea capacitatilor de sorbtie pentru diversi sorbenti de tip II RGS – rumegus de stejar; RGF – rumegus de fag;

3. Caracterizarea microbiologica a turbei si a solurilor contaminate cu produse petroliere

Numeroase microorganisme au capacitatea de a utiliza hidrocarburile gazoase, lichide si solide din seria alifatica, aromatica si asfaltica, drept unica sursa de carbon si energie, descompunandu-le la compusi cu greutate moleculara mai mica si chiar la CO₂ si apa. Raspandite larg in mediile naturale si uneori semnificativ numeric, microorganismele active (bacterii, levuri si fungi filamentosi) ataca diferiti compusi ca petrolul, gazolina, kerosenul, gazul de iluminat, gazele de sonda etc.

Primele observatii asupra acestui proces dateaza din anul 1895, cand Miyoshi a observat ca straturile subtiri de parafina - considerata biologic inerta - sunt patrunse de hifele de Botrytis cinerea. Ulterior Rahm (1906) a demonstrat ca mai multi microfungi din sol, inclusiv Penicillium glaucum, pot ataca parafina, descompunand-o si utilizand-o ca unica sursa de energie.

Importanta fenomenului in natura a fost semnalata de Seyer si Chibnall (1934) pe baza frecventei ridicate a microorganismelor active in sol si a incapacitatii de acumulare a unor hidrocarburi sintetizate de plante, sau a unor ceruri produse de insecte.

Degradarea microbiana a produselor petroliere in ecosistemele naturale reprezinta un caz particular al activitatii microorganismelor, numite de Ahearn (1973) hidrocarbonoclastice. Este un proces complex, a carui evolutie depinde de natura si proportia relativa a diferitilor constituenti din petrol, de natura comunitatilor de microorganisme caracteristice mediilor naturale si de o serie de factori de mediu care influenteaza activitatea acestora.

Microorganismele hidrocarbonoclastice sunt active in cele mai multe soluri. Efectele poluarii solului cu produse petroliere sunt variabile in functie de cantitatea si compozitia sa, de natura solului, de tipul de vegetatie etc.

In anumite conditii cantitatile foarte mici de hidrocarburi pot fi chiar benefice pentru fertilitate: tratarea solului cu cantitati mici de toluen determina initial o scadere temporara a numarului de microorganisme, urmata de o crestere de la nivelul initial de 5 x 10⁶/g la 40 x 10⁶/g. Fenomenul are la baza faptul ca numeroase microorganisme din sol pot folosi ca sursa de carbon si energie, toluenul, ca si alti compusi (xilen, naftalen, hexan, clorbenzen, nitrobenzen, etc).

Deversarea de produse petroliere in sol are drept rezultat o crestere numerica a populatiilor de bacterii, cu o reducere concomitenta a diversitatii lor, respectiv cu predominanta speciilor care degradeaza hidrocarburile la compusi mai simpli, determinand disparitia lor treptata.

Poluarea cu doze mari omoara vegetatia, dar, totdeauna, in special in conditii de aerobioza, in perioade mai mult sau mai putin indelungate au avut loc degradarea si revenirea la normal.

Studiul proceselor de biodegradare a produselor petroliere in conditii stimulate in laborator, ca si in natura a demonstrat dependenta lor de conditiile de mediu si de prezenta si activitatea microorganismelor hidrocarbonoclastice. In unele situatii controlate, adaugarea de microorganisme active, fara modificarea conditiilor de mediu, s-a dovedit ineficienta.

Pornind de la aceste observatii au fost imaginate o serie de masuri de stimulare a biodegradarii - adecvate mediului care urmeaza a fi tratat. Metodele de modificare a mediului sunt variabile, in functie de particularitatile locale.

Lucrarea de fata, propune utilizarea turbei ca sorbent a produselor petroliere ce contamineaza diferite soluri.

Intr-o prima etapa, se propune sa se caracterizeze din punct de vedere chimic si microbiologic, esantioane de turba prelevate de la Poiana Stampei, precum si o caracterizare microbiologica a unei probe de sol puternic contaminata cu produse petroliere.

Pentru a surprinde cat mai bine activitatea microbiana, s-au determinat numeric principalele grupe ecofiziologice de microorganisme implicate in circuitul carbonului si azotului, microorganisme care au in acelasi timp proprietati biodegradative ale compusilor cu carbon si azot prezente in sol sau turba.

4. Determinarea microflorei totale aerobe si anaerobe

Microflora totala aeroba si anaeroba s-a determinat pe medii specifice agarizate, domeniul de dilutii insamantate fiind cuprins intre 10^-1 – 10^-8. Fiecare dilutie s-a insamantat in trei placi Petri.

Mediile utilizate au avut urmatoarea compozitie:

Pentru aerobi:

Extract de sol . . . . . . . . 750 ml

Extract de levuri . . . . . . . . 0,75 g

Agar . . . . . . . . . . . . 18 g

Apa distilata . . . . . . . . . 350 ml

Pentru anaerobi:

Glucoza . . . . . . . . . . . . 5 g

Tioglicolat de sodiu . . . . . . . 1 g

Agar . . . . . . . . . . . . ..18 g

Apa distilata . . . . . . . . ..1000 ml

pH = 7,5

Aprecierea microflorei totale aerobe si anaerobe de microorganisme / ml s-a calculat dupa formula:

unde: N – numarul de microorganisme dintr-un ml de suspensie initiala

A – numarul mediu al coloniilor dezvoltate pe trei placi Petri

10 – coeficientul de dilutie

n – numarul de ordine al dilutiei cu care s-a facut insamantarea

V – volumul in ml de suspensie folosita la insamantare.

Evaluarea grupelor fiziologice de microorganisme

Cunoscand rolul microorganismelor in circulatia materiei in natura – metodele bazate pe principiile elaborate de Pochon si colaboratori se aplica la studiul diferitelor grupe ecofiziologice de microorganisme care realizeaza in natura circuitul carbonului, azotului, sulfului, fosforului etc.

Determinarile s-au facut prin metoda dilutiilor, folosind medii selective lichide dupa metodele Pochon si Tardieux. Zilnic s-a urmarit reactia ce caracterizeaza grupul respectiv, fie prin metabolizarea substratului, fie prin aparitia unui catabolit in mediu.

1. Determinarea microflorei fixatoare de azot atmosferic

Determinarea numarului microorganismelor aerobe fixatoare de azot atmosferic s-a facut prin insamantarea cu dilutii de sol sau turba a unui mediu lichid care nu contine azot combinat avand urmatoarea compozitie:

Solutie salina standard . . . . . . . . . . 50 ml

Manitol . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Extract de sol . . . . . . . . . . . . 10 ml

Solutie oligoelemente . . . . . . . . . 1 ml

CaCO₃ . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g

Apa distilata . . . . . . . . . . . . . 950 ml

Mediul este repartizat in tuburi bine aerate, cate 5 ml de fiecare dilutie (10^-1 – 10^-6). Se apreciaza cultura, in special de Azotobacter, prin formarea unui voal brunificat.

Pentru microorganismele anaerobe fixatoare de azot s-a insamantat cu suspensii dilutii de sol si turba, un mediu cu urmatoarea compozitie:

Solutie salina standard . . . . . . . . .. 50 ml

KH₂PO₄ . . . . . . . . . . . . . . . 0,75 g

NaOH N/10 . . . . . . . . . . . . . 33 ml

Glucoza . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Extract de sol . . . . . . . . . . . . . 10 ml

Solutie ologoelemente . . . . . . . . . 1 ml

Apa distilata . . . . . . . . . . . . 950 ml

Aprecierea culturii (in special Clostridium pasteurianum ) se face printr-o degajare gazoasa. Prezenta gazului este evidentiata in micile clopote de gaz Durham.

2. Determinarea microflorei amonificatoare

Microorganismele amonificatoare realizeaza mineralizarea acizilor aminici, peptidelor si altor substante organice cu azot pana la NH₃, CO₂ si H₂O. Astfel se cerceteaza aparitia amoniacului cu reactiv Nessler. Se insamanteaza cu suspensii dilutii de sol (10^-1 – 10^-18) un mediu salin la care s-a adaugat asparagina ca unica sursade C si N, cu urmatoarea compozitie:

Solutie salina standard . . . . . . . . . . .50 ml

Asparagina . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g

Solutie oligoelemente . . . . . . . . . . .. 1 ml

Apa distilata . . . . . . . . . . . . . . 950 ml

3. Determinarea microflorei nitrificatoare

S-a notat separat prezenta bacteriilor nitroase si nitrice. Doua medii elective lichide au fost insamantate cu suspensii dilutii de sol, cate 0,5 ml pentru fiecare tub, folosindu-se 5 tuburi pentru fiecare dilutie (10^-1 – 10^-6). Pentru cercetarea bacteriilor nitroase azotul este furnizat sub forma de sulfat de amoniu (NH₄)₂SO₄, mediul avand urmatoarea compozitie:

Solutie salina standard . . . . . . . . . . . 50 ml

(NH₄)₂SO₄ . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g

CaCO₃ . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g

Apa distilata . . . . . . . . . . . . . . 950 ml

Iar pentru bacteriile nitrice de azotit de sodiu NaNO₂, mediul fiind alcatuit din:

Solutie salina standard . . . . . . . . . . .. 50 ml

NaNO₂ . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g

CaCO₃ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g

Apa distilata . . . . . . . . . . . . . . . 950 ml

Se testeaza prezenta nitritilor si nitratilor cu reactiv difenilamina sulfurica, iar in cazul nitratilor in prezenta ureei in mediul de acid sulfuric.

4. Determinarea microflorei denitrificatoare

Numarul de microorganisme capabile sa produca in sol denitrificarea se cerceteaza prin disparitia nitratilor in functie de timp, cu reactiv difenilamina sulfurica. Se insamanteaza suspensii dilutii de sol (10^-1 – 10^-12) intr-un mediu lichid in care azotul este sub forma de nitrati (KNO₃), cu urmatoarea compozitie:

Solutie salina standard . . . . . . . . .. 50 ml

KNO₃ . . . . . . . . . . . . . . . .. 2 g

Glucoza . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml

CaCO₃ . . . . . . . . . . . . . . . 5 g

Solutie oligoelemente . . . . . . . . . 1 ml

Apa distilata . . . . . . . . . . . . .. 950 ml

Interpretarea rezultatelor

Toate probele de turba si sol au fost termostatate la +28⁰C. Rezultatele s-au interpretat fata de martori care nu au fost insamantati cu suspensii dilutii de sol.

Lectura rezultatelor s-a facut diferentiat, in functie de grupul de microorganisme cercetat. Microflora totala a fost citita la 3, 5 si 7 zile de incubare a probelor. Pentru numararea coloniilor de bacterii, ciuperci, actinomicete si a numarului de tuburi pozitive pentru dezvoltarea bacteriilor, citirile s-au efectuat dupa 5, 7, 10 zile. Microflora proteolitica, amonificatoare si denitrificatoare s-a citit la 3,5,7,10,12,15 zile de la insamantare. Determinarea bacteriilor nitroase si nitrice s-a facut dupa 20 zile de incubare.

Rezultatele determinarilor cantitative s-au exprimat in numarul de microorganisme/ g sol sau turba, dupa tabelele lui Mc Crady si apoi in log numar de microorganisme/ g sol sau turba (Meynell, G.G., Meynell, E., 1970 ). In cazul acestor interpretari precizia este cu atat mai mare cu cat numarul repetitiilor este crescut. Pe baza acestor rezultate s-a incercat se se reprezente grafic curbele activitatii biologice a microorganismelor studiate.

O cultura pura contine o singura specie sau tulpina microbiana. Numai cu o cultura pura sunt posibile urmatoarele studii: morfologice (forma si marimea celulelor); culturale (caracteristicile de crestere ale culturii pe diferite medii); fiziologice sau biochimice.

Pentru izolarea unui anumit microorganism in cultura pura se pot folosi tipuri speciale de medii. In general, sunt folosite mediile de imbogatire, selective sau diferentiale. Agentii de imbogatire sau selectie pot fi chimici sau fizici.

Pentru realizarea experimentului propus s-a utilizat turba indigena, cultivata pe medii specifice pentru izolarea bacteriilor precum si a fungilor potential prezente in acest substrat.

S-a procedat la izolarea pe medii solide, care se realizeaza prin metoda dilutiilor succesive si prin metoda diseminarii pe suprafata mediului. Cultura de turba care potential contine microorganisme, a fost diluata in apa sterila. Utilizand in acest scop un anumit coeficient de diluare, obtinandu-se in acest fel o serie de dilutii in care numarul celulelor scade in progresie geometrica. Pentru prepararea dilutiilor, apa sterila a fost repartizata in eprubete uscate sterile, cate 9 ml in fiecare eprubeta. Apoi 1 ml din suspensia initiala, (luat cu o pipeta sterila) a fost transferat in prima eprubeta cu 9 ml apa sterila.

Suspensia obtinuta a fost amestecata foarte bine cu ajutorul pipetei prin barbotare, ceea ce a asigurat o buna omogenizare a suspensiei si a redus aderarea celulelor de peretii eprubetei si pipetei. Apoi s-au realizat celelalte dilutii (10^-2 - 10^-10), in acelasi mod.

Dupa realizarea dilutiilor, s-a procedat la insamantarea cu acestea (1 ml suspensie diluata) pe medii solide, repartizate in placi Petri. Pentru fiecare dilutie s-au insamantat cate 3 placi Petri cu mediu Sabouraud si 3 placi cu mediu Czapek - Dox. Incubarea s-a realizat timp de 24 - 96 ore la temperatura de 28⁰C, pentru dezvoltarea culturilor. La finalul perioadei de incubare, pe suprafata placilor Petri au aparut colonii izolate, care au fost repicate in mod steril si trecute in tuburi cu geloza sterila. Termostatarea acestora la 28⁰C a dus la obtinerea dintr-o singura colonie a unei plaje microbiene, care a fost verificata microscopic pentru a se constata puritatea culturii obtinute.

In rezultatele obtinute s-a reusit sa identificarea unor tulpini bacteriene din genul Pseudomonas si Bacillus.

Obtinerea unei culturi pure de fungi a demonstrat prezenta in proba de turba a unor tulpini din genul Penicillum si Aspergillus.

Efectuand analiza probei de turba prelevata de la Poiana Stampei, s-a determinat numarul total de germeni al fiecarui grup fiziologic de microorganisme ce realizeaza circuitul elementelor carbon si azot.

Rezultatele obtinute sunt prezentate in tabelul 6 si reprezentate grafic in figura 4, prin exprimarea in log in baza 2 din numarul de microorganisme determinat.

In acest experiment a fost determinata microflora totala prezenta in proba de turba, constatandu-se ca numarul de microorganisme prezente este de ordinul a 10⁷, ceea ce indica prezenta unei microflore active la pH 5,5, deosebit de activa, cel putin in conditii de laborator. Repartitia acestor microorganisme pe grupe ecofiziologice este data de determinarea microorganismelor celulozolitice, amonificatoare, preoteolitice, fixatorilor de azot, precum si a bacteriilor nitrice, toate acestea concurand la degradarea compusilor organici ce contin carbon si azot.

Tabelul 6. Determinarea principalelor grupe ecofiziologice de microorganisme prezente in turba

Se observa predominanta microorganismelor celulozolitice si amonificatoare, ceea ce demonstreaza capacitatea microorganismelor prezente in turba de a degrada substantele organice ce contin carbon si azot.

Figura Logaritm in baza 2 din numarul de microorganisme determinate in proba de turba.

De asemenea prezenta fixatorilor de azot demonstreaza ca circuitul elementelor carbon si azot care se desfasoara la nivelul turbei este complet, astfel ca acest substrat poate fi utilizat in diverse scopuri microbiologice. Cel mai bine reprezentate sunt grupele celulozolitice si amonificatoare.

Reprezentarea grafica a log in baza 2 din numarul de microorganisme evidentiaza prezenta in cantitate mare a microorganismelor amonificatoare si a microorganismelor proteolitice ce au rol in descompunerea substantelor organice pana la substante mai simple sau dioxid de carbon si amoniac. Cercetarile ulterioare vor demonstra utilitatea prezentei acestor microorganisme in probele de turba in procesul de degradare a produselor petroliere.

Au fost prelevate probe de sol puternic contaminate cu produse petroliere din apropierea unor depozite de benzinarii. Solul respectiv este in contact cu poluantul de mai multi ani, ceea ce ne-a facut sa presupunem ca acolo s-a dezvoltat cu timpul o microflora ce s-a adaptat substratului respectiv. Ca si in cazul turbei am procedat la determinarea principalelor grupe ecofiziologice de microorganisme potential prezente in solul puternic contaminat. Prin insamantarea unor suspensii dilutii de sol pe medii selective care permit dezvoltarea numai a unor grupe de microorganisme si incubarea acestora la 28⁰C timp optim necesar evidentierii activitatii biochimice a acestor microorganisme, s-au obtinut datele prezentate in tabelul 7.

Tabelul.7. Determinarea principalelor grupe ecofiziologice de microorganisme prezente in solul puternic contaminat cu produse petroliere

Analizand datele obtinute se constata prezenta unei microflore totale foarte bogata, de ordinul a 10⁸, ceea ce arata ca in acest sol supus contaminarii cu produse petroliere, in timp s-a dezvoltat o microflora adaptata, capabila sa utilizeze aceste produse in procesul de metabolism. In ceea ce priveste repartitia numerica a microorganismelor se constata prezenta in cantitate mare a microorganismelor amonificatoare si proteolitice, precum si a celor celulozolitice. De asemeni, sunt bogat reprezentati si nitricii si nitrosii cu rol in formarea nitritilor si a nitratilor, asigurand in acest mod sursa de azot necesara celorlalte grupe de microorganisme prezente in sol.

Reprezentarea grafica a logaritmului in baza 2 din numarul de microorganisme, evidentiaza prezenta tuturor grupelor de microorganisme studiate, in proba de sol contaminata, iar prin experimentele viitoare pe care le vom realiza vom putea exploata acest potential microbiologic existent.

Figura 5 . Logaritm in baza 2 din numarul de microorganisme determinate in proba de sol puternic contaminata cu produse petroliere

7. Studiul procesului de sorbtie a hidrocarburilor petroliere

Pe baza studiilor efectuate in faza anterioara a proiectului au rezultat urmatoarele concluzii:

Capacitatea de retentie a turbei pentru produsele petroliere este mai mare decat a celorlalte produse studiate (rumegus). Are o capacitate de sorbtie a produselor petroliere de 6 – 12 ori mai mare decat greutatea produsului – functie de natura hidrocarburii petroliere;

Distributia granulometrica, capilaritatea turbei confera acestui sorbent proprietati absorbante spectaculoase;

Produsul petrolier este retinut in interiorul porilor turbei prin fenomenul de sorbtie.

8. Studiul procesului de biodegradare aeroba a hidrocarburilor petroliere.

Biodegradarea este un proces prin care microorganismele cum ar fi bacteriile, fungii si drojdiile, descompun compusii chimici in produse simple pentru a obtine energie si nutrienti. Procesul de biodegradare a hidrocarburilor petroliere este un proces natural lent.

Tehnologiile de decontaminare prin biodegradare (bioremediere), pot ajuta ca procesul de biodegrardare sa fie accelerat. Astfel pentru indepartarea hidrocarburilor petroliere din mediul afectat prin biodegradare, sunt necesare metode de stimulare a procesului: adaugare de nutrienti (fertilizare) sau adaugare de microorganisme specializate (insamantare).

Biodegradarea hidrocarburilor petroliere existente in diferite medii, in particular in sol, se bazeaza pe de o parte pe utilizarea microorganismelor indigene, deja existente in natura si adaptate la poluantul respectiv, iar pe de alta parte pe introducerea de microorganisme allohtone. Tocmai de aceea in procesul de depoluare, apare de multe ori necesitatea selectarii din multitudinea de microorganisme existente in natura pe acelea care corespund scopului urmarit.

In acest sens, bacteriile de interes sunt selectate din mediile poluate si apoi sunt supuse unui screening de laborator care permite alegerea acelor tulpini sau asociatii care manifesta performantele cele mai bune in degradarea hidrocarburilor reziduale.

In natura, dar si in laborator, microorganismele pot trai si se pot inmulti daca sunt respectate conditiile optime de temperatura, aerare, pH, substante nutritive. Pornind de la aceste considerente generale, s-au selectat dintr-un sol poluat cu produse petroliere, asociatii de microorganisme, adaptate la conditiile de laborator si testate din punct de vedere al capacitatii lor biodegradative.

Pentru realizarea scopului propus, au fost recoltate probe de sol puternic contaminate din apropierea Localitatii Gura Ocnitei, judetul Dambovita.

Experimentele realizate la nivel de laborator au avut ca scop urmatoarele :

Determinarea principalelor grupe ecofiziologice de microorganisme implicate in circuitul carbonului si al azotului.

Izolarea, purificarea si selectarea unor microorganisme cu capacitati biodegradative prezente in probele de sol puternic contaminate.

Adaptarea microorganismelor selectate in conditii de laborator , prin stabilirea conditiilor optime de temperatura, pH, aerare, substante nutritive.

Testarea capacitatii biodegradative a microorganismelor selectate.

Turba (Poiana Stampei-Suceava) si solul contaminat cu produse petroliere luate in studiu, contin un numar mare de diverse microorganisme Tabelele 6 si 7.

In turba indigena s-a identificat prezenta unor tulpini bacteriene din genul Pseudomonas si Bacillus. Numarul de microorganisme prezente in turba este de ordinul a 10⁷, ceea ce indica prezenta unei microflore active la pH 5,5, deosebit de activa, cel putin in conditii de laborator. Obtinerea unei culturi pure de fungi in turba a demonstrat prezenta in proba de turba a unor tulpini din genul Penicillum si Aspergillus

Atat in turba cat si in solul contaminat s-a observat predominanta microorganismelor celulozolitice, amonificatoare ceea ce demonstreaza capacitatea microorganismelor prezente de a degrada substantele organice ce contin carbon si azot. Prezenta fixatorilor de azot si a proteoliticilor in turba demonstreaza ca circuitul elementelor carbon si azot care se desfasoara la nivelul turbei este complet, astfel ca acest substrat poate fi utilizat in diverse scopuri microbiologice. Se poate aprecia ca atat proba de tuba cat si proba de sol contin o mare varietate de microorganisme cu rol in circuitul elementelor biogene si potential capabile sa degradeze produsele petroliere ce contamineaza unele soluri, chiar daca procesul de biodegradare este lent.

Dupa identificarea si determinarea numarului de microrganisme din turba si solul contaminat, in aceasta faza s-a urmarit izolarea, purificarea si selectarea tulpinilor bacteriene din soluri puternic contaminate cu produse petroliere, adaptarea acestor microorgaisme in conditii de laborator si testarea capacitatii lor de a degrada unele produse petroliere (motorina). Se stie ca biomasa microbiana existenta ete un factor important al procesului de biodecontaminare. Astfel, aceste tulpini bacteriene vor putea fi folosite cu succes pentru insamantarea turbei ce va fi folosita in procesul de decontaminare a solurilor poluate accidental cu produse petroliere.

Insamantarea mediilor de cultura. Culturi si colonii microbiene. Obtinerea culturilor pure

Insamantarea unei culturi microbiene consta in depunerea produsului respectiv pe suprafata sau in profunzimea mediilor de cultura. In natura se gasesc culturi pure, insa frecventa cu care se afla intr-un mediu este considerata mica. Pentru izolarea unui anumit microrganism in cultura pura se pot folosi tipuri speciale de medii, izolarea putandu-se face prin mai multe metode. Am folosit cea mai utilizata metoda pentru selectarea si izolarea micoorganismelor – izolarea pe medii solide, care se realizeaza prin metoda dilutiilor succesive.

Rezultate experimentale

Izolarea, purificarea si selectarea unor microorganisme cu capacitati biodegradative. Tehnica de lucru a fost foarte laborioasa si a implicat urmatoarele etape: (1) Efectuarea de suspensii dilutii de sol 10^-1-10^-7; (2) Insamantarea dilutiilor realizate pe medii de cultura solide pentru obtinerea de colonii izolate (fig.1); (3) Replicarea coloniilor izolate si pasarea lor pe medii minerale solide in care unica sursa de carbon a fost reprezentata de motorina (0,5%); (4) Observarea zilnica a dezvltarii microorganismelor insamantate pe substrate. Astfel s-au obtinut colonii microbiene care s-au dezvoltat intr-un mediu ce continea ca unica sursa de carbon motorina.

Figura 6. Colonii  de Pseudomonas sp. izolate

Figura 7. Aspect microscopic al tulpinii din proba de sol contaminata cu produse petroliere de Pseudomonas sp.

Concluzii - microorganismele selectate apartin bacteriilor;

- coloniile sunt rotunde, lucioase si colorate galben-fluorescent;

- sunt forme bacilare (fig.2) si sunt Gram-negative.

Se poate estima ca microorganismele izolate din solul puternic contaminat si care s-au dezvoltat in conditiile in care unica sursa de carbon a fost reprezentata de un produs petrolier (motorina) apartin genului Pseudomonas.