Determinarea activitatii enzimatice a fosfatazelor alcaline (ALP, FA) cu para-nitrofenilfosfat

Determinarea activitatii enzimatice a fosfatazelor alcaline (ALP, FA) cu para-nitrofenilfosfat

Fosfatazele sunt monoesteraze nespecifice care catalizeaza reactia de hidroliza a esterilor fosforici (α-glicerofosfati, fenil-fosfat disodic, para-nitrofenilfosfat,etc.), eliberand acidul fosforic si fenolul sau alcoolul respectiv.

R-O-PO3H₂+H₂O → R-OH + H₃PO₄

Desi, practic, manifesta aceeasi specificitate de substrat, dupa pH-ul optim de activitate, fosfomonoesterazele se clasifica in:

fosfataze alcaline (pH = 9,0-10,4);

fosfataze acide (pH= 5,0-6,0);

fosfataze acide (pH= 3,4-4,2).

Fosfataza alcalina este necesara pentru hidroliza fosfatilor organici fiind larg raspandita in celulele tunilor renali, mucoasa intestinala, tesut hepatic, celulele tractului biliar, celulele glandei mamare si placentei (in timpul sarcinii), precum si in oase, in osteoblasti (dar nu si in osteoclasti), unde indeplineste importantul rol de eliberare a acidului fosforic din diferiti compusi chimici. Detine un rol important in formarea tesutului osos, regenerarea si repararea tesutului hepatic, participand in diferite reactii biochimice (metabolismul glucidelor, lipidelor,  nucleoproteidelor- nucleaze), in procesele de osificare, contractie musculara, resorbtie intestinala,etc.

Determinarile de rutina efectuate in clinica masoara de fapt rezultatul activitatii mai multor enzime de provenienta hepatica, osoasa, renala precum si cele eliberate din peretele intestinal. In ser, cu exceptia celei osoase din perioada de crestere se afla si izoenzima hepatica chiar la nivele crescute.

Principiul metodei: Prin actiunea fosfatazelor alcaline asupra p-nitrofenilfosfatului este pus in libertate p-nitrofenifosfatul intens colorat in galben in mediu alcalin. Activitatea enzimatica este proportionala cu intensitatea coloratiei.

Reactivi:

1.            Solutie substrat-tampon: para-nitrofenilfosfat 5,5.10^-3M-tampon glicocol 0,05 M. pH=10,5. Se dizolva 375 mg glicocol, 10 mg MgCl₂.6 H₂O si 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu in solutie de NaOH 0,1 N. Se completeaza cu apa distilata la 100 ml. pH-ul solutiei trebuie sa fie 10,5. Solutia se poate pastra o saptamana la +4⁰C.

2.            Solutie de NaOH 0,02 N.

Material biologic

3.            Ser nehemolizat.

Tehnica de lucru: In doua eprubete, pentru proba de analizat (P) si pentru martor (M) se pipeteaza:

Se agita. Se incubeaza 30 de minute la 37⁰C, apoi se adauga:

Se citeste extinctia probei si extinctia martorului la 405 nm.

Calcul: Se aplica relatia:

Unde:
18.530= coeficient de absorbtie molar al p-nitrofenolului alcalin la 405nm;

2,22 = volumul final (total) in ml;

0,02 = volumul initial al probei de analizat (ml);

30 = timpul de incubatie (minute).

(E_P-E_M) x 199,7 = UI/L

1 UI fosfataza alcalina reprezinta cantitatea de enzima care catalizeaza hidroliza a 1 µmol de substrat in timp de 1 minut, la 37⁰C si pH=10,5.

Daca se citeste extinctia probei fata de martor la 405 nm, rezultatele se exprima in mU/ml si se calculeaza dupa formula: mU/ml= 200 x E₄₀₅

Valori normale: adulti: 20-48 mU/ml; copii: 38- 138 mU/ml.

Determinarea activitatii fosfatazei alcaline prin metoda Bodansky

Principiul metodei: Se dozeaza fosfatul anorganic eliberat din β-glicerofosfat de sodiu, in timp de o ora la 37⁰C, raportat la 100 ml ser.

Reactivi

1.Solutie acid tricloracetic 5 %.

2.Solutie substrat- tampon: 2,5 g β-glicerofosfat de sodiu si 2,12 dietilbarbiturat de Na, se dizolva in apa si se completeaza la 500 ml.

3.Solutie standard fosfat (se prepara solutie stoc ca la dozarea fosfatului anorganic serie prin metoda Briggs). Se dilueaza solutia stoc 1 ml si apa distilata ad. 50 ml(solutia diluata contine 2 µg P/ml).

4.Solutie molibdat de amoniu: intr-un balon cotat de 500 ml se iau 25 g molibdat de amoniu, se dizolva in 300 ml apa distilata, se adauga 75 ml acid sulfuric concentrat si se completeaza la 500 ml cu apa distilata.

5.Solutie de acid ascorbic 1,5 % (se prepara proaspata in cantitati mici).

6.Solutie standard concentrata de fosfat: 0,4394 g KH₂PO₄  si apa bidistilata 1 000 ml.

Solutia standard concentrata contine 0,1 mg P/ml.

7.Solutia  standard diluata se prepara in 1 ml solutie concentrata si apa ad. 10 ml. Solutia standard diluata contine 10 µg P/ml.

Material biologic

8.Ser.

Tehnica de lucru: Se pregatesc doua eprubete de centrifuga:

Se incubeaza timp de o ora  la 37⁰C, apoi se adauga:

Se centrifugheaza 10 minute, la 3 000 r.p.m., apoi se iau:

Se agita, apoi dupa 30 de minute se citesc extinctiile probei si ale martorului, la 600 nm (filtru rosu), in cuva de 1 cm fata de o proba in alb care contine 2,3 ml apa; 0,6 ml solutie molibdat de amoniu si 0,1 ml acid ascorbic 1,5 %.

Se face de asemenea o proba cu 1 ml solutie standard de fosfat; 1,3 ml apa distilata; 0,6 ml solutie molibdat de amoniu si 0,1 ml solutie de acid ascorbic 1,5 %.

Calcul:  Unitatea Bodansky corespunde unei activitati enzimatice care duce la eliberarea de 1 mg fosfat anorganic timp de o ora la 37⁰C de catre 100 ml ser. La calcul se va tine cont de concentratia standardului (2 µg fosfor) si de faptul ca determinarile de fosfor corespund unei cantitati de 0,075 ml ser (1,5 ml supernatant).

 P/100 ml ser/ora=

(unitati Bodansky)

Valori normale: adulti: 2- 6 u. Bodansky; copii: 6-16 u. Bodansky

Determinarea fosfatazei alcaline. Metoda cinetic-colorimetrica (Medicarom)

Principiul metodei: fosfataza alcalina hidrolizeaza esterul fosforic (para-nitrofenilfosfat) eliberand fosfatul si para-nitrofenolul care este colorat in galben in mediu alcalin.

Reactivi

1.     Solutie tampon ph=10,5.

2.     Solutie substrat.

Material biologic

3.     Ser sau plasma heparinizata.

Tehnica de lucru

Se pipeteaza:

-proba de analizat  0,05 ml

- reactiv 1+2 (la 25⁰C , 30⁰C, 37⁰C; preparat conform prospectului)5 ml

Se amesteca.

Se citeste extinctia initiala, se da drumul in acelasi timp la cronometru.

Se rpeta citirile la 1, 2, 3 minute la 405 nm in cuva de 1 cm contra martor de aer.

Se calculeaza extinctia pe minut.

Calcul:UI/L activitate fosfatazica = 3 300 x E la 405 nm/minut.

Valori normale

25⁰C 30⁰C 37⁰C

Barbati/ femei60- 170 UI/L 73- 207 UI/L 99- 279 UI/L

Determinarea acidului uric in ser

Acidul uric este produsul final al catabolismului acizilor nucleici in organismul uman ca si al maimutelor antropoide. Acizii nucleici pot fi atat de exogeni (alimentari) cat si proveniti din distructia celulelor proprii. Procesul de formare al acidului uric se numeste uricopoeza si are loc in ficat, prin oxidarea enzimatica a bazelor azotate purinice (adenina si guanina).

Acidul uric este transportat in plasma sub forma de urat de sodiu si este excretat in urina (prin filtrare glomerulara, urmata de retroabsorbtie partiala tubulara).

Dozarea acidului uric din ser cu reactiv fosfo-wolframic

Principiul metodei: Acidul uric in mediu alcalin, reduce acidul fosfo-wolframic, cu formarea unui complex (albastru de wolfram) de culoare albastra, a carei intensitate este proportionala cu concentratia acidului uric in proba de analizat.

Reactivi

1.     Reactiv fosfo-wolframic:

Se amesteca 50 g wolframat de sodiu si 40 ml acid fosforic 85 % cu 350 ml apa distilata, intr-un balon de 1 000 ml, prevazut cu refrigerent cu reflux si se fierbe lent, aproximativ 2 ore, dupa racire se completeaza volumul al 500 ml cu apa distilata. Daca reactivul este verde, se adauga 1-2 picaturi de brom si se fierbe cateva minute fara refrigerent, pentru indepartarea excesului de brom. Reactivul are culoarea galben-verde deschis, se pastreaza in sticla bruna si este inalterabil.

2.     Acid tricloracetic 20 %.

3.     Solutie de carbonat de sodiu cristalizat 22 %.

4.     Solutie standard de acid uric (solutie stoc): 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic, 100 ml fosfat monosodic se dizolva in aproximativ 60 ml apa distilata calda (60⁰C) si se agita pana la completa dizolvare. Dupa racire, se completeaza la 100 ml cu apa distilata, intr-un balon cotat.

1 ml solutie etalon= 1 mg avid uric.

5.  Solutia etalon de lucru se prepara prin diluarea solutiei stoc ; 1 ml solutie etalon stoc se aduce la 100 ml apa distilata.

Material biologic

6.     Ser

Tehnica de lucru

Intr-o eprubeta de centrifuga se pun: 1 ml ser, 2 ml apa distilata si 1 ml acid tricloracetic 20 %.

Se amesteca prin usoara agitare si se lasa la temperatura camerei 5 minute.

Se centrifugheaza la 2 500-3 000 r.p.m., aproximativ 5 minute.

Dupa aceasta se realizeaza urmatoarea schema experimentala:

Dupa 10 minute se masoara extinctia probei de analizat (E_P) si a standardului (E_S)fata de proba in alb, la 710 nm.

In cazul aparitiei unei opalescente, se centrifugheaza.

Calcul

mg acid uric/100 ml ser= E_P/E_S x 0,02 x 200

in care:  0,02= concentratia solutiei etalon in cei 2 ml luati in lucru

200       = mg%, tinand cont de dilutia probei (0,5 ml ser).

Determinarea acidului uric prin metoda standardizata

Principiul metodei: Acidul uric reduce reactivul fosfowolframic, in mediu alcalin, formand un complex colorat in albastru, a carei intensitate ets proportionala cu concentratia acidului uric din proba de analizat. Deoarece acidul ascorbic interfera, acesta este neutralizat de valoareaa ph-ului (10-11) a solutiei tampon.

Reactivi

1.Solutie acid sulfuric N/12.

2.Solutie wolframat de sodiu 10 %.

3.Solutie reactiv fosfowolframic. Se dizolva 25 g wolframat de sodiu in 20 ml apa distilata. Se adauga 20 ml H₃PO₄ cu d= 1,71 si se fierbe 4 ore cu refrigerent cu reflux. Dupa racire se aduce la 250 ml cu apa distilata.

4.Solutie tampon cu pH=12,5 (3 g glicocol in 100 ml NaOH 1 N).

5.Solutie standard (stoc) de acid uric/100 ml. Se dizolva 100 mg acid uric si 50 mg Li₂CO₃ in 20 ml apa distilata, incalzindu-se la 60⁰C. se adauga 30 ml apa distilata, 2,5 ml formaldehida 40 % si 0,3 ml acid caetic glacial. Se amesteca si dupa racire se aduce la 100 ml cu apa distilata.

6.Solutie standard de lucru. Se dilueaza 0,5 ml solutie standard stoc cu 10 ml apa distilata. Solutia contine 5 mg acid uric la 100 ml apa distilata.

Material biologic

7.Ser.

Tehnica de lucru: Se procedeaza la deproteinizare prin pipetare in eprubete de centrifuga:

Se agita puternic

Se agita si apoi se lasa in repaus 10 minute. Se centrifugheaza.

Se agita, apoi se lasa 1 minut la temperatura camerei.

Se agita eprubetele energic si se lasa in repaus.

• Dupa 15-30 minute se masoara extinctia probelor (E_P) si standardului (E_S) fata de proba martor la 710 nm in cuve de 1 cm.

Calcul:

E_P/E_S x 5 = mg acid uric/ 100 ml ser

in care:

5= concetratia solutiei standard de lucru

Dozarea acidului uric prin metoda enzimatica

Principiul metodei: Acidul uric este tranformat de uricaza la alantoina si apa oxigenata care sub actiunea catalitica a peroxidazei oxideaza acidul 3,5-diclor-2-hidroxibenzensulfonic si 4-aminofenazona pentru a forma un compus chinoniminic de culoare rosu-violet.

Acid uric+O₂+2H₂O alantoina + CO₂ + H₂O₂

2H₂ O_{2 +} acid 3,5-dicloro-2-hidroxibenzensulfonic + 4 aminofenazona

N-(4-antipiril)-3-cloro-5-sulfonat-p-benzochinonimina

Reactivi:

1.Solutie tampon: - tampon fosfat 50 mmol/l;

- pH=7; acid 3,5-dicloro-2-hidroxibenzensulfonic 4 mmol/l.

2.Solutie reactiv enzimatic:

4-aminofenazona 0,3 mmol/l;

peroxidaza 1 000 U/l;

uricaza 200 U/l.

3.Solutie standard 10 mg/dl (595 mmol/l)

Material biologic:

4.Ser sau plasma.

Tehnica de lucru

Reactivul enzimatic se prepara intr-o eprubeta cu 15 ml tampon. Stabilitatea solutiei la 2-8⁰C este de 21 de zile iar la 15-25⁰C de 5 zile daca se pastreaza la intuneric.

Se realizeaza urmatoarea schema experimentala:

Se amesteca, se incubeaza 15 minute la 20-25⁰C.

Se masoara extinctia probei si a standardului fata de blanc, in interval de 30 de minute de la adaugarea ultimului reactiv, la 520 nm in cuve de 1 cm la 20-25⁰C.

Calcul:

Pentru ser sau plasma:

concentratia acidului uric= 10 x (E_P/E_S) (mg/dl)

concentratia acidului uric = 595 x (E_P/E_S) (mmol/l)

Observatii

- Metoda este lineara pana la concentratia de 20 mg/dl sau 1,189 mmol/l. Peste aceasta valoare se dilueaza proba 1:1 cu solutie fiziologica si rezultatul se inmulteste cu 2.

- Hemoglobina pana la 100 mg/dl si bilirubina pana la 20 mg/dl nu afecteaza determinarea.

Valori normale

3-7 mg acid uric/100 ml (0,178- 0,420 mmol/l)

Valorile normale variaza in functie de numerosi factori:

sex:

- barbati: 3,5 - 7,5 mg/100 ml (0,210 - 0,445 mmol/l)

- femei: 2,5 - 6,5 mg/100 ml (o,150 - o,390 mmol/l)

varsta:

nou-nascutii prezinta valori mai mari decat adultii;

copiii prezinta valori mai mici decat adultii.

● alimentatie bogata in purine (viscere, carne, cacao, ciocolata, cafea, spanac, conopida, mazare, fasole, linte), duce la cresterea valorilor uricemiei.

● efortul fizic mareste uricemia.

● la menopauza valorile uricemiei sunt mai mici decat cele din perioada activa sexuala, apoi odata cu inaintarea in varsta devin egale cu cele ale barbatilor.

● exista o variatie in cursul unei zile, valorile fiind mai scazute noaptea.

Semnificatie diagnostica:

Patologia acidului uric este dominata de guta, boala specifica omului. Excesul unei uricemii provine fie dintr-un defect de uricogeneza, fie dintr-o tulburare in procesul de eliminare a acidului uric.

Hiperuricemiile se datoreaza unei uricogeneze crescute, unei reduceri a uricoeliminarii renale sau a acestor doua patogenii care actioneaza concomitent. Hiperuricemia corespunde tabloului clinic al gutei, care se manifesta prin precipitarea cristalelor de acid uric in tesuturile moi si periarticulare, producand inflamarea acestora ("tofi" gutosi).

Dozarea acidului uric are valoare in diagnosticul si urmarirea efectului tratamentului in guta si ca indicator al catabolismului masiv al acizilor nucleici in toxemia gravidica, dupa radioterpia tumorilor, dupa tratamentul cu agenti citotoxici.

Dozarea calciului

Calciul este un constituent important din punct de vedere cantitativ al organismului, reprezentand aproximativ 2 % din greutatea corpului (de exemplu intr-un adult de 70 kg exista 1,1 kg de calciu):
 ● 90 % in schelet (ca hidroxiapatita si saruri amorfe de calciu);

● 10 % in celule (legat de proteine in membranele celulare, mitocondrii, nucleu si in lichidul extracelular).

Calciul patrunde in organism pe cale alimentara, este absorbit la nivelul intestinului subtire sub actiunea vitaminei D₃ si a hormonului paratiroidian. Odata cu inaintarea in varsta diminua resorbtia calciului in intestin.

In organismul uman, calciul se gaseste sub diferite combinatii precum:

CaCl₂ in umori;

CaF₂ in smaltul dintilor;

CaCO₃ si Ca(HCO₃)₂  in vase sangiune si saliva;

Ca(PO₄)₂ si Ca₅(PO₄)₃OH (hidroxiapatita) in oase.

Plasma sanguina cuprinde o cantitate relativ constanta de calciu, acesta fiind constituit din trei fractiuni distincte din punct de vedere fizic si fiziologic:

Calciul ionizat difuzabil si ultrafiltrabil, care consta din ioni liberi de Ca²⁺, activ fiziologic = 50 %.

Ioni complexati de molecule mici, cum este acidul citric, fosfatul si bicarbonatul de calciu (calciu difuzabil neionizat); aceasta fractiune reprezinta 5 % din calciul plasmatic total; sub aceasta forma isi exercita calciul functiile sale specifice;

Calciul nedifuzabil, care consta din ioni de Ca²⁺ fixati mai mult sau mai putin labil de proteinele plasmatice, in special albumine (80 %) si globuline (20 %) = 43-47 %.

Primele doua forme de calciu trec prin membrana glomerulara in timp ce a treia forma de calciu nu difuzeaza.

Calciul ionizat functioneaza si ca mesager intracelular, fiind legat sau eliberat de catre proteine intracelulare specifice.

Calciul difuzabil este cel mai susceptibil de a suferi variatii cantitative.

Intre diferitele forme ale calciului exista un echilibru dinamic, trecerea dintr-o forma in alta realizandu-se in limitele impuse de mentinerea acestui echilibru.

Alcaloza scade nivelul Ca²⁺ , ducand la cresterea calciului legat de proteine; acidoza are efect invers.

Reglarea nivelului calciului plasmatic, respectiv al celui ionizat, se realizeaza prin mecanisme variate, ca de exemplu:
▪ gradul de absorbtie (conditionat de cantitatea si tipul alimentelor ingerate);

▪ raportul dintre calciul din tesutul osos si cel din lichidul extracelular (hipocalcemia este compensata de mobilizarea calciului din oase, iar hipercalcemia implica depozitarea calciului in oase sau alte tesuturi);

▪ homeostazia eliminarii (in special renale);

▪ reglare hormonala prin hormoni paratiroidieni (parathormonul si calcitonina), tiroidieni (calcitonina), sexuali,etc.

Parathormonul are efect hipercalcemiant prin favorizarea absorbtiei intestinale, resorbtiei calciului din oase (stimularea osteoclastelor) si inhibarea eliminarii urinare de calciu.

Calcitonina secretata de glanda tiroida si paratiroida ca raspuns la cresterea Ca²⁺ plasmatic, determina scaderea Ca²⁺ prin: inhibarea activitatii osteoclastelor si a resorbtiei osoase; reducerea absorbtiei intestinale a calciului alimentar si cresterea excretiei renale de calciu (si scaderea excretiei de fosfat).

▪ interventia vitaminelor D (calciferolii) care favorizeaza absorbtia calciului la nivelul epiteliului intestinal si renal, de proteinele plasmatice si fosfatii din ser, de raportul de sinergism si antagonism al calciului cu alti ioni;

▪ hormonii corticosteroizi inhiba functia osteoblastilor conducand catre o osteoporoza incipienta (terapia prelungita cu corticosteroizi), spre deosebire de estrogeni care stimuleaza osteoblastii favorizand formarea de osteoid, bogat in proteine (osteoporoza presenila prin deficit de estrogeni).

In organism, calciul exercita diferite roluri. Astfel :
◊ participa la excitabilitatea neuromusculara (ionii Ca²⁺ scad aceasta excitabilitate);

◊ participa la mecanismul contractiei musculare;

◊ initiaza motilitatea celulara;

◊ calciul este esential pentru procesul de coagulare al sangelui;

◊ intervine in permeabilitatea celulara (ionii Ca²⁺ si AMP- ciclic sunt implicati in transferul ionilor anorganici de-a lungul membranelor celulare si la eliberarea neurotransmitatorilor);

◊ este activator al unor enzime (lipaza, fosfataza alcalina, ATP-aza musculara,etc);

◊ regeleaza secretia parathormonului si a calcitoninei

In explorarea biochimica a sangelui determinarea calciului ionizat prezinta o semnificatie majora, deoarece aceasta fractiune este cu predominanta cea functional activa. Dozarile se efectueaza pe ser sau plasma care contine, practic, in exclusivitate calciul sanguin ionizabil (in eritrocite se gasesc urme nedozabile de calciu).

Determinarea calciului prin fotometrie de flacara

Principiul metodei: Determinarea prin fotometrie de flacara (este metoda de electie, daca aparatul permite determinarea). In flacara de acetilena se elimina aproape complet interferenta sodiului, pe cand in flacara de propan aceasta influenta este puternica.

Reactivi

1.Solutie etalon stoc de calciu, 10 mg/100 ml (5 mEq/litru): 0,547 g CaCl₂. 6H₂O (sau 0,277 CaCl₂ anhidru), 0,382 g KCl pur, 7,635 g NaCl si apa bidistilata ad. 1 000 ml. Contine 100 mg calciu/litru.

2.Solutie etalon diluata de calciu: solutia etalon stoc de calciu se dilueaza cu apa bidistilata 1/100 inainte de intrebuintare.

Material biologic:

3.Ser diluat 1/100 cu apa bidistilata

Tehnica de lucru:

Cu ajutorul solutiei etalon se traseaza o curba de etalonare a aparatului, iar pentru determinare se dilueaza serul cu apa bidistilata in proportie de 1/100, astfel ca sa ne incadram in curba de etalonare.