Extractia ADN la salmonide

Extractia ADN la salmonide

Izolarea ADN genomic se realizeaza avand la baza un proces de extractie in trei etape. In prima etapa are loc liza celulelor si a nucleelor acestora intr-o solutie continand detergent si EDTA. Eliminarea ARN din extractul de acizi nucleici se realizeaza cu ajutorul unei solutii de RNA-aza. In etapa urmatoare sunt precipitate proteinele folosind un amestec de solventi organici, in timp ce ADN genomic cu masa moleculara mare ramane in solutie. In final, ADN genomic este concentrat si desalifiat prin precipitare cu etanol absolut. Peletul de ADN precipitat este spalat cu etanol rece 70%, apoi dupa o etapa de centrifugare, urmata de indepartarea etanolului, peletul de ADN este uscat si resuspendat in apa ultrapura sau tampon TE (Tris EDTA).

Reactivi si aparatura

Fragmente de inotatoare.

EDTA 0,2 M, N-lauroylsarcozinat de sodiu 5%.

Pronaza 20 mg/ml, RNA-aza 2 mg/ml.

Fenol, cloroform, alcool izoamilic, etanol absolut si 70%, apa ultrapura.

Tuburi de centrifuga sterile de 1,5 ml.

Agitator  REAX Top (Heidolph).

Microcentrifuga MiniSpin (Eppendorf).

Termobloc TDB 120 (Biosan).

Mod de lucru

Ziua I

1.     Intr-un tub Eppi de 2 ml se adauga 340 µl EDTA (etilen diamin-tetraacetic acid, tetra sodic x 2 H₂O) 0,2 M, 800 µl sarcosyl 0,5% (in apa) si 25µl pronaza 20 mg x ml^-1.

2.     Se adauga tesut in fiecare tub (50 mg inotatoare sau 100 mg muschi scheletic).

3.     Se amesteca usor si se incubeaza peste noapte, 15-16 ore la 37sC.

Ziua II

1.     Se adauga 10 µl de RNA-aza in fiecare tub, se amesteca si se incubeaza la 37sC timp de o ora.

2.     Se adauga 400 µl fenol (pH = 8) in fiecare tub. Se agita puternic fiecare tub aproximativ 20 secunde si apoi mult mai usor timp de 10 minute (prin inversia repetata a tubului sau prin vortexare la viteza mica).

3.     Se adauga 400 µl cloroform:alcool izoamilic (24:1) in fiecare tub. Se agita puternic timp de 20 secunde, apoi mult mai usor timp de 10 minute.

4.     Se centrifugheaza tuburile la  13400 rpm timp de 3 minute.

5.     Cu o pipeta automata, se indeparteaza cu atentie stratul apos superior si se transfera intr-un nou tub.

6.     Se repeta pasii 6, 7, 8 pe faza superioara nou transferata.

7.     Se adauga doua volume de etanol 100% rece peste faza apoasa transferata in tub. Se amestaca prin inversia rapida a tubului de 5-6 ori.

8.     Se centrifugheaza 3 minute la 13400 rpm si apoi se arunca etanolul prin inversia tubului.

9.     Intr-un interval de maxim 15 minute se decanteaza cu atentie etanolul. Se adauga 1 ml de etanol 70% si se spala pentru cel putin o ora prin agitare usoara.

10.  Se centrifugheaza 3 minute la 13400 rpm si apoi se decanteaza etanolul 70% adaugat, indepartand excesul prin inclinarea tubului.

11.  ADN se usuca la 37˚C timp de 10-15 minute si se resuspenda in apa PCR. Se lasa cel putin 24 de ore pentru dizolvare completa la 4˚C.

Puritatea si concentratia probelor ADN se verifica spectrofotometric cu ajutorul spectrofotometrului BioRad. Raportul optim A₂₆₀/ A₂₈₀ este cuprins intre 1,8 si 2. Daca raportul inregistreaza valori sub 1.8, solutia ADN este contaminata cu proteine, iar daca valoarea acestuia depaseste 2.0, cantitatea de ARN din proba este peste limita admisa si va interfera cu operatiile ulterioare. In cazul excesului de ARN se pot constata amplificari nespecifice sau hibridizari intre ARN-primeri si ARN-ADN. Atunci cand apare contaminarea se repeta pasii specifici de purificare pana se obtine o valoare care sa fie cuprinsa in domeniul optim.

Integritatea ADN a fost verificata prin electroforeza in gel de agaroza 1%.