ADNmt la salmonide

ADNmt la salmonide

Dezvoltarea markerilor ADN a avut un impact puternic asupra geneticii animalelor. Tehnologiile bazate pe markeri ADN au revolutionat modul in care sunt conduse cercetarile asupra pestilor, si implicit asupra salmonidelor. Dezvoltarea geneticii moleculare, de la folosirea pe scara larga a alozimelor incepand cu deceniul sapte al secolului trecut pana la proiectul genomului uman si alte realizari la fel de spectaculoase au pus bazele acestei discipline cu un larg domeniu de actiune.

Markerii moleculari au permis progrese rapide in studiile asupra variabilitatii genetice si incrucisarilor selective, determinarii paternitatii, identificarii speciilor, populatiilor si subpopulatiilor.

Metodele de identificare a stocurilor de salmonide si a variabilitatii genetice din cadrul populatiilor au fost imbunatatite pe masura inregistrarii unor noi progrese in domeniul markerilor moleculari. Descrierea morfologica si analiza morfometrica au fost primele unelte folosite pentru a defini speciile de salmonide, dar tehnicile de biochimie si biologie moleculara si-au gasit rapid locul in astfel de studii, inlaturand dubiile legate de o clasificare corecta, mai ales ca la pesti apare frecvent fenomenul hibridizarii interspecifice.

De la publicarea secventei complete a genomului mitocondrial uman (ADNmt) de catre Aderson et al., (1981), organizarea genomului mitocondrial la o serie de organisme eucariote a fost bine caracterizata (Wolstenholme, 1992). La pesti ADNmt este o molecula mica (~16,5 kpb), dublu catenara, circulara. La ora actuala sunt diponibile in intregime secventele de ADNmt de la 67 de specii de pesti (NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/ 7898.html). Datorita recombinarii relativ scazute de la nivelul ADNmt si modului de mostenire exclusiv pe linie materna, ADNmt reprezinta un marker valoros cu un real potential de utilizare in studii de genetica a populatiilor si filogenie.

Salmonidele sunt pesti cu importanta comerciala mare si cresterea intensiva in conditii de acvacultura a devenit o preocupare insemnata in multe tari din Europa. Ca urmare, este importanta cunoasterea caracteristicilor ADNmt pentru identificarea stocurilor si pentru derularea eficienta a unor programe de conservare si management eficiente, cat si in studiul variabilitati genetice a populatiilor (Phillips & Oakley, 1997). In cadrul familiei Salmonidae, secventa completa a ADNmt este cunoscuta si disponibila in bancile de date pentru urmatoarele specii: O. mykiss (Zardoya et al., 1995), Salmo salar (Hurst et al., 1999), S. alpinus (Doiron et al., 1999), C. lavaraetus (Miya & Nishida, 2000) si S. fontinalis (Doiron et al., 2002).

Similar organizarii de la vertebrate, genomul mitocondrial al pestilor contine 37 de gene, dintre care 13 gene ce codifica pentru proteine, 22 de gene pentru ARNt si 2 gene pentru ARNr corespunzatoare transcriptilor 12S si 16S (Figura 1). De exemplu, in cazul speciei S. salar pozitia si orientarea genelor mitocondriale si a regiunii de control este similara organizarii observate la alte specii de pesti sau vertebrate superioare. Cu toate ca organizarea genomului mitocondrial la vertebrate este destul de conservata, la unele specii au fost descrise anumite rearanjamente ale genelor (Kumazawa et al., 1996). In ceea ce priveste marimea exprimata in perechi de baze (pb) a genomului mitocondrial, aceasta este uniforma la speciile de pesti analizate, diferentele fiind doar de cateva zeci de pb intre speciile de salmonide (de exemplu, la O. mykiss 16 642 pb - Zardoya et al., 1995 -, la S. salar 16 665 pb - Hurst et al., 1999, la S. alpinus 16 659 pb - Doiron et al., 1999, la C. lavaraetus 16 737 bp - Miya & Nishida, 2000, etc.).

Figura 1: Organizarea genomului mitocondrial la Salmo salar. Sunt indicate enzimele de restrictie folosite pentru clonare in studiul efectuat de Hurst et al., 1999. Numerele reprezinta lungimea in perechi de baze (pb) cu originea stabilita arbitrar la capatul 5' al regiunii D-loop. Genele pentru ARNt sunt denumite cu o singura litera pentru aminoacidul respectiv (de exemplu, K pentru lisina).

Regiunea de control (D-loop)

Intre genele ARNt^Pro si ARNt^Phe ale vertebratelor se gasesete o regiune necodificatoare care variaza ca lungime (Wolstenholme, 1992). Regiunea mitocondriala de control (D-Loop) reprezinta regiunea reglatoare bine conservata a genomului mitocondrial al vertebratelor, implicata in initierea replicarii ADN pe catena H, si contine secvente promotoare pentru transcriptia ARN (Clayton, 1982, 1984; Saccone et al., 1991). La mamifere si amfibieni s-a constatat ca aceasta secventa contine semnale necesare initierii replicarii catenei grele (heavy - H) si a fost desemnata ca regiune de control pentru transcrierea ambelor catene mitocondriale, grea (heavy - H) si usoara (light - L) (Shadel & Clayton, 1997). In cazul salmonidelor, regiunea D-loop este asemanatoare ca lungime la speciile studiate si contine 986 pb la O. tshawytscha, 1006 pb la S. salar, 1003 pb la O. mykiss, 964 pb la S. fontinalis, 998 pb la S. alpinus si 1076 pb la C. lavaretus.

Zarodya et al., 1995 au propus la O. mykiss o structura stabila de tipul stem-loop pentru acesta regiune, constand din 11 nucleotide pereche in regiunea stem si o bucla de 17 nucleotide. La S. salar a fost propusa o structura secundara asemanatoare, regiunea stem fiind alcatuita din

12 nucleotide pereche, iar regiunea loop din 13 nucleotide. Secventa 5'-GCCGG- 3' este conservata in cazul vertebrtatelor, fiind identificata atat la om, cat si la si la unele specii de salmonide la baza regiunii stem (Figura 2).

Secventa structurii stem este conservata la vertebrate, in timp ce secventa structurii loop prezinta o mai mare variabilitate. In cazul mamiferelor, prin secventierea regiunii loop s-a observat ca aceasta prezinta o secventa bogata in timina necesara initierii replicarii catenei L.

Figura 2: Structura secundara pentru originea replicarii catenei L la 6 specii de salmonide. Secventele asociate cu tranzitia intre sinteza ARN si sinteza ADN sunt subliniate.

In cazul mai multor specii de salmonide, structura loop a regiunii de control este bogata in citozina. Astfel, se pare ca initierea replicarii catenei L nu este conditionata de prezenta timinei, cum s-a crezut initial, ci de prezenta unui lant polipirimidinic. Cateva regiuni ale genei D-loop prezinta un anumit grad de variatie intre populatiile aceleiasi specii, dar variabilitatea nu este uniforma si regiunea de control mitocondriala prezinta anumite regiuni bine conservate in seria vertebratelor (Brown et al., 1985). Gena mitocondriala D-loop a fost selectata ca marker pentru diverse studii de filogenie mitocondriala deoarece este considerata cea mai variabila zona mitocondriala in ceea ce priveste rata de substitutie si marimea zonelor variabile ( Meyer, 1993). De asemenea, o variabilitate ampla a zonei D-loop a fost evidentiata la S. trutta din diferite regiuni din Europa (Bernatchez et al., 1992; Bernatchez & Osinov, 1995; Osinov & Bernatchez, 1996; Apostolidis et al., 1997).

Referat: Interviu cu Maestrul sportului FIDE Tiberiu Georgescu Referat: Fotbalul la 14-18 ani

Genele care codifica pentru proteinele implicate in fosforilarea oxidativa

Genomul mitocondrial la salmonide, similar celorlalte vertebrate, contine 13 gene care codifica pentru subunitati proteice implicate in procesul de fosforilare oxidativa.

La eucariote, fosforilarea oxidativa se desfasoara la nivelul cristelor mitocondriale si foloseste energia rezultata prin oxidarea nutrientilor pentru a produce in final ATP. In timpul fosforilarii oxidative, electronii sunt transferati in timpul unor reactii redox de la donorii de electroni la acceptorii de electroni, de exemplu O₂. In timpul proceselor redox are loc eliberarea de energie, care este folosita pentru sinteza ATP. La eucariote, reactiile redox sunt realizate de o serie de complexe proteice mitocondriale interconectate ce formeaza lantul transportor de electroni.

Genele care codifica pentru molecule implicate in functionarea lantului transportor de electroni din mitocondrie sunt urmatoarele: genele pentru 7 subunitati ale NADH dehidrogenazei (complexul I - NADH/ ubiquinona) - NADH I, NADH II, NADH III, NADH IV L , NADH IV, NADH V si NADH VI, gena pentru citocrom b (complexul III - coenzima Q-citocrom c reductaza/ citocrom b), genele pentru cele trei subunitati ale complexului citocrom c oxidazei (CO) (complexul IV) - CO I, CO II si CO III si genele pentru cele doua subunitati ale ATP sintazei (ATP 6 si ATP 8).

Genele mitocondriale pentru NADH dehidrogenaza codifica 7 subunitati ale acestei enzime (numite si NADH: quinon oxidoreductaza) localizate in membrana mitocondriala interna care catalizeaza transferul electronilor de la NADH la coenzima Q. NADH dehidrogenaza este cea mai mare dintre moleculele complexelor respiratorii. Prezinta o structura in forma de L cu un domeniu membranar lung (la mamifere, aproximativ 60 de helixuri trans-membranare) si un domeniu periferic hidrofil, ce contine o serie de centri redox si un situs de legare pentru NADH.

Gena mitocondriala pentru citocrom b codifica pentru proteina citocrom b/b6, principala componenta a complexului respirator III. Proteina b/b6 este o proteina integrala de membrana de aproximativ 400 de aminoacizi cu 8 segmente transmembranare. Gena mitocondriala cyt b codifica pentru o proteina transmembranara conservata si informativa din punct de vedere filogenetic pentru studii inter si intra-specifice (Meyer, 1993).

Genele mitocondriale CO I, CO II si CO III codifica pentru trei subunitati ale citocrom C oxidazei (complexul IV). Citocrom C oxidaza este o metaloproteina transmembranara complexa, de mari dimensiuni, localizata la nivelul membranei mitocondriale, care catalizeza transferul de electroni de la citocromul c redus la oxigenul molecular in timpul respiratiei celulare. Este alcatuita din cateva grupari prostetice si 8 subunitati proteice, dintre care 3 sunt codificate de gene mitocondriale si restul de gene nucleare. Complexul citocrom oxidazei C contine contine doua grupari hem, citocrom a si citocrom a₃ si doua centre continand ioni de cupru (Cu_A si Cu_B). Cele trei subunitati mari (I, II si III) ale enzimei, catalizate de genele mitocondriale, formeaza situsul catalitic al enzimei deoarece ele poarta grupari hem si centrii redox Cu²⁺.

Genele pentru ATP sintaza codifica subunitatile 6 si 8 ale enzimei ATP sintaza ce catalizeaza reactia de sinteza a ATP din ADP si pirofosfat utilizand energia generata de miscarea protonilor din spatiul intermembranar in matricea mitocondriala. ATP sintazele joaca un rol crucial in aproape toate organismele, forma de energie utilizata de celule fiind preponderent ATP.

Din cele 13 gene, 12 sunt codificate de catena H, si numai una , NADH VI, este codificata de catena L.

In general, la diferite specii de salmonide se intalneste o mare omolgie a secventelor nucleotidice si a secventelor aminoacizilor (Tabel 3). Codonii START sunt in majoritatea cazurilor ATG, exceptie facand codonul START al genei CO1, care este GTG. Acest codon de initiere atipic a fost descris in cazul genei CO1, la mai multe specii de pesti (Zardoya et al., 1995). La S. salar, opt dintre secventele genelor ce codifica pentru proteine prezinta codonul STOP TAA si doua codonul STOP TAG. Restul genelor (CO2, NADH IV, cyt b) nu prezinta un codon STOP complet, ci un singur rest de timina, similar cazurilor intalnite la om si la Xenopus. La acestea s-a demonstrat ca transcriptul acestor gene contine un codon STOP complet TAA care este creat post-transcriptional prin poliadenilare. Zardoya et al., 1995 au sugerat ca un fenomen similar celui mentionat anterior este intalnit si la speciile de salmonide care contin in genomul lor mitocondrial un codon STOP incomplet TAA.

Tabel 3: Procentul de nucleotide (Nt) si aminoacizi (AA) cu secvente identice la diverse specii de salmonide.

Genele pentru ARNr 12S si 16S

ARNr este o molecula ancestrala si totodata un marker important folosit drept ceas molecular al evolutiei. Diferitele tipuri sunt prezente in nucleu, citoplasma si organite. Este conservat structural si functional chiar si la specii foarte indepartate filogenetic, suferind modificari minore si reprezentand o sursa de informatii pentru tot spectrul evolutiv.

ARNr reprezinta componenta centrala a ribozomilor, sediul sintezei proteice. ARNr ofera mecanismul pentru decodarea ARNm in aminoacizi si interactioneaza cu moleculele de ARNt in timpul translatiei, posedand activitate peptidil transferazica. Speciile diferite de ARNr sunt caracterizate de prin coeficientul de sedimentare (Tabel 4).

La salmonide (de exemplu, S. salar, O. tschawytscha) genele pentru ARNr sunt localizate intre genele pentru ARNt^Phe si ARNt^Leu (UUR) si sunt separate de gena pentru ARNt^Val (Figura 3).

Figura 3: Organizarea genelor mitocondriale pentru ARNr la salmonide.

Aliniamentul genelor ribozomale de la diferite specii de salmonide a aratat ca identitatea secventelor nucleotodice prezinta valori ridicate, ceea ce confirma faptul ca aceste gene sunt foarte conservate la aceste specii (Tabel 3). In schimb, aliniamentul cu genele similare de la alte specii de pesti si mamifere a relevat un anumit patern al segmentelor conservate ce alterneaza cu secvente variabile.

Tabel 4. Speciile de ARNr.

O caracteristica interesanta a genelor pentru ARNr 16S la diverse specii de salmonide este prezenta unor cadre deschise de citire (ORF - Opening Reading Frame) scurte (Fig. 4). Atunci cand secventele de ARNr 16S de la salmonide au fost folosite intr-un program de traducere a acizilor nucleici, au fost identificate cateva peptide de marimi diferite. Singurele ORF selectate erau cele care codificau pentru minim de 24 de aminoacizi, se gaseau in aproximativ aceeasi pozitie a genei ARNr 16S si prezentau o mare omologie a secventei la cele sase specii de salmonide luate in studiu. Secventa peptidica respectiva prezinta o identitate de 97,8% a aminoacizilor la diferite specii de salmonide. Un ORF similar a fost identificat in pozitia 1223 - 1377 a catenei H a ARNr 16S la O.tschawytscha. Totusi, peptida codificata de acest ORF prezinta o omologie mai scazuta a secventei aminoacizilor la diferite specii de salmonide si este alcatuita din 49 (S. salar), respectiv 60 (O. mykiss) aminoacizi.

Figura 4: Secventa peptidei codificate de ORF in gena pentru ARNr 16S la sase specii de salmonide. Numerele corespund pozitiei ocupate in gena ARNr 16S (Wilhelm et al., 2003).

Descoperirea acestei secvente bine conservate de 24 de aminoacizi codificate de gena ARNr 16S a nascut intrebari legate de rolul fiziologic al acesteia, intrebari sustinute si de descoperirile relativ recente de la om. Niikura et al., 2002 au identificat o peptida similara celei de la salmonide de 24 de aminoacizi, numita humanina, un factor ce protejeaza neuronii de apoptoza in boala Alzheimer familiala. Aceasta peptida este codificata de gena mitocondriala ARNr 16S si ORF a fost identificat in acest caz intre pozitiile 963 si 1037 ale genei pentru ARNr 16S. Un ORF similar a fost localizat in gena mitocondriala pentru ARNr 16S de la salmonide (Figura 3). Astfel este posibil ca aceste peptide sa aiba un rol functional la salmonide. Descoperirea peptidei conservate de 24 de aminoacizi demonstreaza inca o data caracterul versatil al genelor care codifica pentru ARNr ilustrat de localizarea nucleara, localizarea citoplasmatica, rolul in dezvoltarea celulelor liniei germinale si activitatea chaperon-like.

Genele pentru ARNt

Genomul mitocondrial al vertebratelor contine 22 de gene pentru ARNt.

ARNt este o molecula mica (de obicei, de 74 - 95 nucleotide) care transfera aminoacizii in timpul translatiei la nivelul polipeptidului in crestere la situsul ribozomal al sintezei proteice. ARNt prezinta o structura secundara (sub forma de frunza de trifoi) si o structura tertiara (sub forma literei L care permite intercatiunea optima cu situsurile ribozomale implicate in translatie).

Figura 5. Structura tertiara a ARNt (www3.interscience.wiley.com).

Molecula de ARNt prezinta in structura ei 4 brate (acceptor, DHU, pesudouridinei si anticodon) si 3 bucle (DHU, pseudouridinei si anticodon). Uneori, prezinta o bucla variabila. Sinteza ARNt are loc in doua etape. Initial are loc sinteza moleculei de ARNt cu exceptia bratului acceptor, acelasi pentru toate moleculule de ARNt, care este adaugat ulterior. Bratul acceptor reprezinta situsul unde un aminoacid specific este atasat de amino-acil-tRNA sintaza. Regiunea anticodon contine trei nucleotide complementare codonului de pe ARNm. Fiecare molecula de ARNt poate fi atasata unui singur aminoacid, dar datorita degenerarii codului genetic, molecule de ARNt cu secventa anticodon diferita pot transporta acelasi aminoacid.

Figura 6. Structura secundara a ARNt (www3.interscience.wiley.com).

Genele pentru ARNt se gasesc intr-un numar diferit in genomul diferitelor organisme (620 de gene pentru ARNt la C. elegans, 275 la S. cerevisiae). La om exista 497 de gene nucleare, 22 de gene ribozomale si 324 pseudogene pentru ARNt. Similar organizarii de la alte vertebrate, genomul mitocondrial de salmonide contine 22 de gene pentru ARNt, dispuse intre genele pentru ARNr si cele pentru proteine.

La O. tshawytscha, 14 dintre aceste gene sunt codificate de catena H si 8 sunt codificate de catena L, similar altor specii de salmonide. Toate cele 22 de gene pentru ARNt prezinta o structura secundara sub forma de frunza de trifoi si plierea in acest tip de structura secundara necesita formarea legaturilor G-U (Wolstenholme, 1992). La S. salar, genele ARNt prezinta o lungime cuprinsa intre 68 pb si 75 pb si exceptand ARNt pentru Ser (AGY), toate celelalte gene pentru ARNt prezinta structura secundara tipica inalnita la seria vertebratelor. La diverse specii de salmonide (S. salar, O. mykiss, S. alpinus, S. fontinalis, C. lavaretus), secventa ARNt^Met este bine conservata. Bucla DHU de la ARNt^Met este conservata in seria vertebratelor, avand o secventa similara cu cea intalnita la speciile de salmonide mentionate anterior. Similar, bucla DHU de la ARNt Leu prezinta o secventa inalt conservata la vertebrate si similara cu cea de la O. mykiss, S. salar si alte specii de salmonide. Se considera ca motivul pentru care aceasta secventa este atat de conservata este pentru ca este absolut necesara transcrierii genelor ARNr si ARNt (Shadel & Clayton, 1997).

Caracteristicile ADNmt

Cele doua tipuri de ADN, nuclear si mitocondrial, prezente in celulele vertebratelor, au o origine si o evolutie diferita. ADNmt deriva din materialul ereditar al bacteriilor ca si consecinta a incorporarii acestor microorganisme in precursorul celulelor eucariote (teoria endosimbiotica).

ADN mitocondrial prezinta o serie de caracteristici:

. mostenirea pe linie materna: acest fapt faciliteaza monitorizarea transmiterii diferitelor caractere de-a lungul unor linii evolutive, incepand din stadii timpurii ale evolutiei. In cazul in care unul dintre indivizii luati in studiu nu este disponibil cu o proba biologica, orice proba care provine de al genitorul matern este valabila si poate fi utilizata cu succes.

. nivel crescut de variatie a secventei nucleotidice: ADNmt prezinta un nivel ridicat de variabilitate si o rata crescuta a mutatiilor comparative cu ADN nuclear, in ciuda faptului ca nu codifica pentru sinteza unui numar mare de proteine. Studiile de la vertebrate au aratat ca divergenta de secventa se acumuleaza mai rapid in ADNmt decat in cel nuclear (Brown, 1985). Acest fenomen a fost atribuit unei rate a mutatiilor mai rapida in ADN mitocondrial care poate fi rezultatul lipsei mecanismelor de reparare in timpul replicarii. De exemplu, numarul mare de polimorfisme intalnite la nivelul a doua regiuni hipervariabile din regiunea de control mitocondrial permite discriminarea intre diferiti indivizi sau diferite probe biologice.

. rata de evolutie rapida: ADNmt prezinta o rata de evolutie mult mai rapida decat genomul nuclear, fapt ce ii confera o mai buna rezolutie in studii de filogenie la specii foarte apropiate.

. lipsa de recombinare: o alta caracteristica a ADNmt, general acceptata ca un avantaj real pentru studii de genetica populationala, este lipsa de recombinare. Majoritatea animalelor prezinta un tip de reproducere sexuata. In acest tip de reproducere genele sunt transmise de la ambii genitori dupa recombinarea prin crossing-over si segregarea independenta a cromozomilor in timpul meiozei. Procesul de recombinare lipseste in cazul genelor mitocondriale deoarece genomul mitocondrial este transmis uniparental.

. genom compact: aceasta caracteristica permite analiza mai usoara a genomului mitocondrial comparativ cu cel nuclear. Genomul mitocondrial este mai mic, uniform ca marime (15 - 18 kb la pesti) si astfel, poate fi mai usor de manipulat. In plus, posibilitatea de a obtine ADNmt din probe biologice foarte mici sau chiar de degradate este mai mare decat in cazul ADN nuclear, deoarece moleculele de ADNmt se gasesesc in mii de copii/celula, in timp ce ADN nuclear prezinta doar doua copii/celula.

Toate aceste proprietati recomanda ADNmt ca fiind un marker foarte util in studii moleculare la pesti, putand fi folosit la:

- discriminarea intre specii diferite de salmonide si identificarea hibrizilor;

- determinarea relatiilor filogenetice si filogeografice la salmonide. ADN mitocondrial contine informatia genetica care permite cercetatorilor sa deduca relatiile intre speciile inrudite si istoria unei specii.

- studii de caracterizare genetica a populatiilor;

- programe de acvacultura - de exemplu, in identificarea stocurilor de salmonide.