Biotehnologia transferului de embrioni la vaca

Transferul de embrioni este o tehnologie prin care embrionii preimplantationali sunt recoltati din uterul femelei donatoare si transferati in uterul femelei receptoare, pentru continuarea gestatiei. Aceasta tehnologie implica folosirea hormonilor gonadotropi pentru inducerea superovulatiei femelei donatoare si tratamente de sincronizare, prin care femela donatoare de embrioni si femela receptoare de embrioni manifesta estrul sincron. Transferul de embrioni are urmatoarele etape:

Alegerea femelelor donatoare de embrioni;

Inducerea superovulatiei femelelor donatoare de embrioni;

Alegerea femelelor receptoare de embrioni;

Sincronizarea estrului receptoare donatoare de embrioni;

Recoltarea embrionilor;

Aprecierea calitatii (viabilitatii) embrionilor;

Transferul embrionilor propriu-zis.

1. Alegerea vacilor donatoare

Alegera se bazeaza pe trei criterii principale:

- superioritatea genetica

- abilitate reproductiva

- valoarea de piata a produsilor obtinuti.

Referitor la superioritatea genetica, vacile donatoare din rasele de lapte se aleg dintre femelele cu index de selectie ridicat. Femela potentiala donatoare de embrioni trebuie sa aiba completa cel putin o lactatie, cu toate ca indicele de selectie devine mai exact cu fiecare lactatie incheiata. In plus, se iau in consideratie si criteriile de calificare dupa conformatie.

Lactatia, atat la vacile de lapte, cat si la cele de carne, nu reduce parametrii reactiei ovariene la tratamentele de inducere a superovulatiei, cu conditia ca vacile sa fie ciclice si sa nu scada in greutate in timpul lactatiei.

La alegerea femelelor donatoare se tine seama si de starea de intretinere a acestora, cunoscand faptul ca tulburarile carentiale influenteza negativ reactia ovarelor la stimularea hormonala.

Referitor la varsta, vacile cu varsta cuprinsa intre 3 si 8 ani dau cele mai bune rezultate la tratamentele de inducere a superovulatiei. La vaca, perioada optima pentru inceperea tratamentelor de inducere a superovulatiei este intervalul de 60-80 de zile de la fatare, dupa ce au trecut de varful productiei de lapte. La vacile din rasele de lapte, se considera ca indispensabila manifestarea, cel putin, a unui ciclu estral complet intre fatare si tratamentele de stimulare hormonala.

Femela potentiala donataoare de embrioni trebuie sa aiba o superioritate genetica demonstrata a caracterelor de importanta economica, si sa aiba o abilitate reproductiva recunoscuta.

Managementul vacilor donatoare de embrioni

Vacile donatoare de embrioni pot fi intretinute fie in ferma fie in centru de embriotransfer.

Intretinerea animalelelor in ferme este alternativa cea mai ieftina, mai ales daca acestea sunt in lactatie. Datorita faptului ca recoltarea embrionilor se va efectua in ferma trebuie sa existe o buna comunicare cu personalul.

In ferme, rezultatele obtinute in urma tratamentelor de inducere a superoulatiei sunt mai slabe comparativ cu centrele de embriotransfer. Rezultatul depinde in mare masura de profesionalismul fermei.

In centrul de embriotransfer vacile sunt furajate adecvat si sunt monitorizate in permanenta (examen clinic al aparatului genital, manifestarea caldurilor, tratament ginecologic etc ).

Mentinerea starii de sanatate - cu cel putin doua luni inainte de inceperea tratamentului de inducere a superovulatiei, femelele donatoare de embrioni vor fi supuse unui regim complet de tratamente antiparazitare si vaccinari impotriva principalelor boli infectioase (tuberculoza, leucoza bovina ).

Intretinerea si furajarea - la doua luni de la fatare, vacile trebuie sa fie in stare buna de intretinere. Intretinerea necorespunzatoare influienteaza negativ tratamentele de inducere a superovulatiei.

Daca vacile donatoare sunt intretinute pe pasune este necesara suplimentarea furajarii cu 5-6 kg fan de buna calitate si 2-4 kg de concentrate/animal/zi.

Cu o luna inainte de inceperea tratamentelor de inducere a superovulatiei, este necesar suplimentarea hranei cu premixuri minerale (Se, Zn, I, Cu, P) si premixuri vitaminice.

Stresul - de orice natura poate influenta negativ numarul embrionilor recoltati, temperaturile necorespunzatoare pe parcursul tratamentelor de inducere a superovulatiei, provoaca o eliberare de cortizol, ca raspuns la stres, ceea ce reduce efectul foliculostimulator al FSH.

Caldurile excesive sau frigul pot conduce la obtinerea unui procent ridicat de ovocite nefecundate si embrioni degenerati.

Cand este prea cald, vacile donatoare trebuie tinute la umbra si sa nu se deplaseze pe distante prea mari. Se recomanda ca lucrarile de embriotransfer sa nu se efectueze in lunile de iarna sau in lunile cu calduri prea mari.

Efectuarea tratamentelor de inducere a superovulatiei – sunt efectuate de membrii echipei de embriotransfer, medicul veterinar care asigura asistenta veterinara in ferma. Depistarea estrului- aprope toate etapele tehnologiei transferului de embrioni sunt programate in functie de semnele clinice ale manifestarii caldurilor la vaca donatoare. De aceea depistarea caldurilor este foarte importanta atat pentru donatoare cat si pentru vaca receptoare de embrioni. Atat vacile donatoare cat si cele receptoare trebuie sa fie verificate daca sunt in calduri cel putin de doua ori pe zi.

Insamantarea artificiala – in general se recomanda doua IA, prima la cca. 12 de ore, iar a doua la 24 de ore de la inceputul caldurilor.

Deoarece ovulatia se esaloneaza pe un interval de cca. 24 de ore, se poate efectua si o a treia IA, la 36 de ore de la inceputul estrului. Se recomanda verificarea calitatii materialului seminal folosit la insamantarea vacilor donatoare. Se utilizeaza numai material seminal de calitate buna, cu un procent ridicat de spermatozoizi viabili. Sperma se va depune in corpul uterin.

2. Inducerea poliovulatiei la vacile donatoare de embrioni

Poliovulatia este procesul de maturare si eliberare, in acelasi ciclu estral, a unui numar mai mare de ovocite, decat numarul caracteristic.

Numarul ovulatiilor este determinat de hormonul care stimuleaza dezvoltarea foliculilor ovarieni (FSH) si de hormonul care induce ovulatia (LH). Tratamentele pentru inducerea superovulatiei au ca scop stimularea ovarelor pentru a produce un numar cat mai mare de ovocite mature intr-un ciclu estral.

Acest obiectiv poate fi realizat prin tratamentul vacilor donatoare de embrioni cu hormoni foliculostimulatori (FSH-sau PMSG), care stimuleaza cresterea si maturarea foliculilor ovarieni.

Principalul tratament de inducere a superovulatiei consta in compensarea, prin una sau mai multe administrari de (PMSG sau FSH) la nivelul plasmatic scazut de FSH endroge, observat in ultimile zile care preced ovulatia.

Efectul hormonilor foliculostimulatori in inducerea superovulatiei consta in actiunea lor directa asupra cresterii foliculilor preantrali si antrali timpurii (Chang si colab. 1978; Moor si colab. -1980).

Procedee de inducere a poliovulatiei

In prezent, tratamentele de stimulare foliculara incep in intervalul 8-14 zile ale ciclului estral (ziua estrului fiind considerata ziua 0 ), perioada in care vacile donatoare raspund cel mai bine la tratamentele de inducere a superovulatiei.

Mapletoft (1987) recomanda ca tratamentele de inducere a superovulatiei sa inceapa in a-9-a zi a ciclului estral.

La inceputul practicarii lucrarilor de embriotransfer, tratamentele de inducere a superovulatiei au fost aplicate in faza foliculara a ciclului estral.

Cel mai bun moment de administrare a hormonului   foliculostimulator era considerata ziua a-16-a a ciclului estral, la debutul fazei foliculare, cu conditia ca femela sa aiba ciclul estral regulat la 21 de zile.

Intervalul de timp dintre momentul administrarii hormonilor foliculostimulatori si ovulatia poate influenta reactia ovarelor la tratament.

Foliculii din ovarele bovinelor au nevoie de 4-5 zile pentru a junge la maturitate. Prin urmare, tratamentele de inducere a superovulatiei trebuie sa fie asociate cu o metoda de control a estrului.

Prostaglandina F₂a (P_gF₂a) constituie mijlocul de ajustare a intervalului de timp de la inceputul tratamentului de stimulare ovariana si pana la estru, (Fig. 5).

Fig. 5. Principiul tratamentelor de inducere a superovulatiei la vaca (Nibart si Bouysson,1981).

La vaca se folosesc urmatoarele procedee de inducere a superovulatiei:

- inducere a superovulatiei cu FSH;

- inducere a superovulatiei cu PMSG;

- inducere a superovulatiei cu   PMSG/ser anti PMSG;

- inducere a superovulatiei FSH si gestagene.

Reactia ovarelor la tratamente de inducere a superovulatiei se apreciaza dupa urmatorii parametri:

- intensitatea reactiei ovarelor (dupa numarul de corpi galbeni);

- numarul total de embrioni recoltati;

- numarul si proportia embrionilor viabili;

Inducerea superovulatiei cu FSH

Hormonul de stimulare foliculara (FSH) extras din hipofiza de mamifere (de la suine) are activitate biologica de scurta durata (40-80 min), din aceasta cauza este nevoie de repetarea administrarii de doua ori pe zi la interval de 12 ore, timp de 4-5 zile.

Dozele toatale de FSH sunt de 25-35 mg pentru vitele si 30-50 mg pentru vaci, administrate in 8 doze crescande la interval de 12 ore timp de 4-5 zile, Protocol de inducere a superovulatiei cu FSH la vacile donatoare de embrioni este redat in (Tabelul 2).

Tabelul 2. Protocol de inducere a superovulatiei cu FSH la vacile donatoare de embrioni (Mapletof, 1987)

Ziua ciclului estral	AM	PM
	5 mgFSH	5 mg FSh
	4 mg FSH	4 MG FSH
	3 mg FSH 0.500 mg Cloprosrenol	3 mg FSH Proiect: Gripa aviara - lucrare de specialitate (Diagnostic, tratament si combatere)
	2 mg FSH	2 mg FSH
Total 28 mg FSH
	Debutul estrului	I.A
	I.A	I.A

Daca femelele nu reactioneaza la dozele uzuale, acestea pot fi marite cu 50% dar la doze mai mari de FSH, exista riscul scaderii numarului embrionilor transferabili.

Astfel in cercetarile sale Schmaidt si colab. (1992) au administrat vacilor din lotul experimental o cantitate totala de 35 mg FSH/femela in cate o inoculare zilnica, timp de 3 zile in doze descrescande( 14 mg, 12.25 mg, 8.75 mg) , iar celor din lotul martor li s-a administrat aceeasi doza in doua inoculari, timp de 4 zile(2x 7mg, 2x 5.3 mg, 2x 5 mg si 2x 1.75 mg).

La 72 de ore de la prima inoculare cu FSH, femelelor li s-au administrat 0.75 mg Cloprostenol.

Insamantarile s-au efectuat la 12 si 24 de ore la debutul caldurilor. S-au recoltat in medie 9.2 embrioni de la femele din lotul experimental si 6.4 de la femelele din lotul martor. Se poate concluziona ca administrarea de FSH o data pe zi timp de 3 zile, induce o reactie similara cu doua administrarii/zi timp de 4 zile.

Majoritatea tratamentelor, confirma afirmatia potrivit careia, in urma tratamentelor de inducere a superovulatiei cu FSH intensitatea reactiei ovariene la stimularea hormonala este mai redusa, dar se obtin mai multi embrioni transferabili, comparativ cu tratamentele cu PMSG.

Inducerea superovulatiei cu PMSG

Gonadotropina serica (PMSG sau serul de iapa gestanta) este produsa de cupele endometriale ale iepelor, incepand cu ziua a 31-45-a de gestatie, atinge un nivel max. de 55-77 de zile si dispare dupa 120-130 de zile de gestatie. Cupele endometriale sunt de origine embrionara, rezultand din grefarea celulelor trofoblastului printre celulele epiteliului uterin (Allen si Moor, 1972).

Utilizarea PMSG in tratamentele de inducere a superovulatiei are avantajul ca este mai ieftin, iar tratamentul mult mai simplu, deoarece are o perioada lunga de metabolizare (5-6 zile) si este sufiecienta o singura administrare pentru inducerea superovulatiei, (Tabelul 3).

Tabelul  Protocolul de inducere a superovulatiei cu FSH la vacile donatoare de embrioni (Roberston, E., 1999).

Perioada lunga de metabolizare a PMSG–ului constituie un dezavantaj, deoarece poate conduce la suprastimularea ovarelor, in ziua recoltarii embrionilor, in prezenta unor foliculi neovulati. In momentul estrului PMSG–ul nu este in totalitate metabolizat si stimuleaza o noua crestere foliculara, cu secretie de estrogeni care perturba primele stadii de dezvoltare embrionara, cu implicatii negative asupra calitatii embrionilor recoltati.

Rezultatele mai multor cercetari au demonstrat: cu cat sunt mai mari dozele PMSG cu atat este mai intensa reactia ovarelor la tratamentele de inducere a superovulatiei, creste viabilitatea numarului si scade numarul embrionilor transferabili (Rowson, 1951; Lamond, 1970; Schamas si colab., 1978; Pacala, 1996).

Concluzia este ca 3000 U.I PMSG–ului este doza cea mai ridicata prin care se poate obtine un raspuns superovulator satisfacator (Greve, 1981).

In prezent, in lucrarile intreprinse se administreaza 2 500 U.I. PMSG (Serogonadin, Folligon sau Intergonan) in dimineata zilei a 10-a a ciclului estral, iar in a 12-a zi se administreaza 0.500 mg Cloprostenol. Femelele donatoare intra in calduri la cca. 60 de ore de la administrarea Cloprostenolului.

Prima IA se efectuiaza la primele semne de calduri, dupa care se mai efectueaza inca doua IA, la interval de cca. 12 ore. Intensitatea reactiei ovarelor la stimularea cu PMSG este mai mare comparativ cu stimulari cu FSH, in schimb se obtin mai putini embrioni transferabili (Boland si colab., 1978; Pacala si colab., 1998).

Inducerea superovulatiei cu PMSG/ser anti- PMSG

Perioada lunga de metabolizare a PMSG-ului este o caracteristica importanta, deoarece ofera posibilitatea inducerii superovulatiei printr-o singura administrare. Insa exista si un inconvenient deoarece dupa ovulatie, concentratiile sanguine ale PMSG-ului sunt inca suficient de crescute pentru a stimula din nou ovarul. Aceasta stimulare tardiva este urmata de o noua crestere a foliculilor ovarieni (suprastimulare ovariana) a caror secretie de 17 –estradiol influenteaza negativ numarul embrionilor transferabili. Anticorpii anti-PMSG, injectati la inceputul estrului, au menirea sa inactiveze hormonul. Asocierea PMSG cu serul anti-PMSG permite marirea dozelor de PMSG si repetarea tratamentelor de inducere a superovulatiei. S-a studiat eficienta unui astfel de protocol de inducere a superovulatiei, care da rezultate comparabile cu FSH, chiar mai bune, adica cu cel putin 5 embrioni transferabili/donatoare, asa cum este redat in Tabelul 4).

Tabelul 4. Rezultatele obtinute in tratamentele de inducere a superovulatiei la vacile donatoare de embrioni (Dieleman si Bevers, 1987).

Referitor la momentul administrarii serului anti-PMSG(2 ml) s-a constatat un procent mai mare de ovulatii daca acestea se administreaza la 60 de ore dupa tratamentul de inducere a superovulatiei.

Inducerea superovulatiei FSH si gestagene

In ultimii ani pentru a se reduce variabilitatea reactiei ovarelor la stimularea cu hormoni gonadotropi, se folosesc tot mai frecvent hormonii gestageni. Stimularea hormonala poate incepe fara referinta la ziua manifestarii caldurilor. Datorita acestui fapt, lucrarile de stimulare hormonala si recoltare a embrionilor se pot efectua simultan la mai multe femele donatoare. Durata lucrarilor de inducere a superovulatiei, recoltarea si transferul embrionilor este de 18 zile, spre deosebire de lucrarile clasice care dureaza 24-25 de zile.

Hormonii gestageni sunt reprezentati de Progesteron si Nergestomet, acestia sunt administrati sub diferite forme:

- implant subcutanat;

- dispozitive intravaginale.

Odata cu hormonii gestageni se admnistreaza si hormoni estrogeni. Hormonii estrogeni au rolul:

de a induce inovulatia unui corp galben functional;

de a impiedica ovulatia si formarea unui corp galben;

stimularea aparitiei unui val de crestere foliculara la cca. 5 zile de la administrare.

Inceperea tratamentelor cu FSH in ziua a-5-a de la administrarea gestagenelor corespunde cresterii finale a foliculilor mici si mijlocii 'salvandu-i 'de la atrezie, deci tratamentele de inducere a superovulatiei nu epuizeaza ovarele, salveaza foliculii si implicit, ovocitele care in conditiile fiziologice se pierd. Administrarea de FSH exogen nu mareste numarul de ovocite care se maturizeaza in timpul unui ciclu estral, salveaza ovocitele care se degradeaza la fiecare ciclu estral (Pacala si colab. -2001). Protocolul de inducere a superovulatiei este redat in protocoalele din (Fig. 6) si (Fig. 7

Ca sursa de hormoni gestageni s-a folosit preparatul Synchro Mate-B (SMB), o doza este formata dintr-un implant cu 3 mg Norgestomet si 2 ml. Solutie injectabila care contine 3 mg Norgestomet si 5 ml valeriat de estradiol. Implantul s-a aplicat subcutanat pe fata externa a urechii, odata cu aceasta s-a administrat intramuscular si solutia injectabila. Ziua implantului se considera ziua 0 a protocolului de stimulare hormonala.

In vederea inducerii superovulatiei s-au utilizat extracte hipofizare de FSH in doza totala de 400 mg, divizat in 8 doze de cate 50 mg, administrate la intervale de 12 ore.

Odata cu ultimele doze de FSH s-au administrat cate 25 mg Lutalyse. Protocol de inducere a superovulatiei vacilor donatoare cu FSH si implant Norgestomet care este redat in tabelul 5. Implantul cu Norgestomet a fost retras in dimineata zilei a 9-a odata cu administrarea ultimelor doze de FSH si PgF₂ά, (Tabelul 5).

Tabelul 5. Protocol de inducere a superovulatiei vacilor donatoare cu FSH si implant Norgestomet (Robertson E., 1999).

S-au efectuat trei IA in ziua a 11-a si in a 12-a, embrionii au fost recoltati nechirurgical in ziua a 18-a de la inceputul stimularii hormonale, ziua a 7-a de la estru indus, iar la trei zile de la recoltarea embrionilor s-au administrat 25 mg Lutalyse. S-au obtinut 20 de embrioni la recoltare, din care 13 embrioni transferabili. Proportia embrionilor transferabili din totalul embrionilor recoltati a fost de 63%. Se poate observa o uniformitate a stadiului de dezvoltare a embrionilor recoltati, deoarece majoritatea au fost in stadiul de blastocist, stadiul caracteristic varstei de 4 zile, (Tablul 6).

Tabelul 6. Protocol de inducere a superovulatiei vacilor donatoare cu FSH si doua implante Norgestomet (Robertson E., 1999)

Daca se folosesc CIDR (Controlled Intravaginal Drug Release– dispozitiv intravaginal cu Progesteron), aceasta se plaseaza in vagin si se mentine timp de 6-8 zile.

La utilizarea CIDR, pot sa apara unele probleme cum ar fi:

- expulzarea acestuia din vagin;

- iritarea mucoasei vaginale, mai eles in sezonul cald;

- aparitia unor vaginite usoare, care nu pun probleme donatoarelor.

Atunci cand femelele receptoare de embrioni se sincronizeaza cu CIDR, vaginitele pot diminua ratele de gestatie.

Factorii care influenteza reactia ovarelor la tratamentele de inducere a superovulatiei sunt:

tipul de hormoni foliculostimulatori; diversele preparate farmaceutice de stimulare foliculara; nivelul dozei de gonadotropine; administrarea hCG sau GnRH; sezonul si a nivelul nutritional al ratiei; stadiul ciclului estral; varsta; rasa; intervalul de timp de la fatare pana la tratamentele de inducere a superovulatiei; stadiul lactatiei; populatia de foliculi ovarieni; variabilitatea individuala.

Sincronizarea estrului femelelor receptoare

si donatoare de embrioni

Reusita transferului de embrioni este conditionata de simultaneitatea evolutiei stadiilor ciclurilor sexuale ale femelei donatoare si receptoarelor de embrioni. Metoda hormonala consta, fie in administrarea de progestane (norgestomet – 3 mg, sub forma de implant + 2 ml solutie injectabila subcutanat, ce contine 3 mg norgestomet si 5 mg valerianat de estradiol), fie 20-30 mg PGF2 naturala sau 0,500 mg cloprostenol

4. Alegerea femelelor receptoare de embrioni

Femelele receptoare sunt selectate pe baza examenului clinic extern si intern. Este de preferat ca acestea sa nu prezinte afectiuni ale aparatului genital, care sa puna in pericol desfasurarea gestatiei (endometrite, salpingite, cervicite).

Pentru aceste considerente, se realizeaza examen transrectal si ecografie transrectala. (Robertson, E. 1999)

5. Recoltarea embrionilor

La vaca se utilizeaza doua categorii de metode:

- Chirurgicale;

- Nechirurgicale.

Recoltarea chirurgicala este folosita numai in scopul obtinerii embrionilor in stadii timpurii de dezvoltare necesari cercetarii stiintifice sau la femele tinere al caror cervix nu poate fi penetrat cu sondele de recoltare a embrionilor.

Exista mai multe procedeie de recoltare nechirurgicala:

- sistemul de recoltare cu distanta fixa

- sistemul de recoltare cu distanta variabil;

- sistemul de recoltare realizat prin perfuzarea coarnelor uterine cu un cateter flexibil cu doua sau trei cai

6. Aprecierea calitatii embrionilor

Aprecierea calitatii embrionilor este o etapa importanta a embrio-transferului, deoarece astfel se poate stabili rata embrionilor transferabili si se cunosc posibilitatile de efectuare a unor manipulari embrionare necesare pentru aplicatiile stiintifice ale acestei biotehnologii.

Aprecierea calitatii embrionilor pe baza criteriilor morfologice se bazeaza pe examenul microscopic, luandu-se in considerare: culoarea (claritatea) embrionului, omogenitatea si dimensiunile blastomerelor, granularea citoplasmatica, gradul de fragmentare a blastomerelor, conturul embrionului.

Pe baza morfologiei lor, embrionii pot fi clasificati in urmatoarele categorii:

- foarte bun; bun; satisfacator; slab (netransferabil)

7. Transferul de embrioni la femelele receptoare

Transferul embrionilor pe cale nechirurgicala necesita utilizarea pistoletului de insamantare artificiala Cassou sau dispozitive speciale, care se introduc in cornul uterin. Inainte de transfer se executa obligatoriu un examen clinic transrectal al femelelor receptoare, pentru a avea certitudinea ca prezinta un corp galben bine conturat pe un ovar.

Transferul nechirurgical are unele inconveniente:

- deficienta patrunderii prin cervix, mai ales la vitele, deoarece transferul se face in stadiul de metestru, cand cervixul este inchis;

- apare riscul lezionarii endometrului cu dispozitivul de transfer, ceea ce ar putea provoca fie infectii uterine, fie ar putea declansa contractii uterine urmate de eliminarea embrionului transferat.

Ratele de gestatie, la 3 luni dupa transfer sunt de 55-65% prin metoda nechirurgicala si de 60-70% prin metodele chirurgicale.