Coprocultura - transportul probelor, examinarea primara a prelevatului

COPROCULTURA:

Indicatii :

- diagnosticul enterocolitelor,bolilor diareice, toxiinfectiilor alimentare, evoluind sub forma acuta, subacuta,cronica, clinic inaparenta sau simplu portaj.

In etiologia acestora vor fi luate in cosiderare enterobacteriile patogene, pentru care diagnosticul etiologic este obligatoriu, si anume:Shigella, Salmonella si E. Coli enteropatogen(EPEC) la copii , pina la virsta de doi ani.

In anumite situatii clinice(disbacterioze) se pot avea in vedere si alte grupe de enteropatogeni, conditionat patogene,precum Psudomonas spp ,alte Enterobacterii(Proteus spp,Citrobacter spp) in cazul sindromului diareic al nou nascutului se va avea in vedere Klebsiella spp(Enterocolita necrozanta a nou nascutului) iar in etiologia toxiinfectiilor alimentare trbuie avut in vedere si Stafilococul auriu(coagulazo-pozitiv).

1. PRELEVAREA  PROBELOR  :

Pentru recoltare se folosesc coprorecoltoare sterile.

Prelevarea trebuie facuta cit mai aproape de debutul bolii si inaintea instituirii oricarui tratament antimicrobian. Produsul ce permite cele mai multe izolari, indiferent de forma clinica,este scaunul proaspat ,emis spontan, din care se preleva cu ajutorul tijei coprorecoltorului portiuni din scaun cu mucus si eventual urme de singe, iar cind lipsesc se recolteaza boluri fecale din 2-3 locuri diferite. Volumul recoltei trebuie sa fie minimum 3-5 cm 3(3-5 g),iar daca scaunul este lichidrecoltorul trebuie umplut in proportie de ½.

TRANSPORTUL PROBELOR:

REGULA:

Transportul prelevatelor de materii fecale destinate examenului bacteriologic se va face in cel mai scurt timp(2 ore dela prelevare).Orice prelevat care nu se insaminteaza pe medii de izolarea(medii de imbogatire sau selective)trebuie supus unui proces de conservare, cerinta indeplinita daca se folosesc coprorecoltoare cu mediu de transport.

Mediul Cary-Blair, larg folosit la noi in tara si utilizat si in laboratorul nostru, este un mediu semisolid, care contine Tioglicolat de sodiu,Fosfat disodic,Clorura de sodiu, Clorura de calciu si Agar si care s-a dovedit util pentru prezervarea Enreobactericeelor(Salmonella,Schigella,Yersinia enterocolitica) cit si pentru enteropatogenii din genul Vibrio(V. cholerae , V. parahaemolyticus).

B.EXAMINAREA PRIMARA A PRELEVATULUI:

1.EXAMEN MACROSCOPIC

Examenimarea macroscopica se efectueaza pe scaunul emis spontan si se apreciaza:

-mirosul ,culoarea,aspectul(muco -sanguinolent,muco-purulent, lichid,cu sau fara lambouri de mucoasa epiteliala).

2. EXAMEN MICROSCOPIC DIRECT( cu caracter orientataiv)

Examen microscopic direct -microscopie optica, ce include examinarea de preparate umede/ colorate(coloratie cu albastru de metilen) si pe preparate fixate (coloratie Gram).

- Coloratia cu albastru de metilen: o ansa putin incarcata cu materii fecalese amesteca cu 2 picaturi solutie cu albastru de metilen si se acopera cu o lamela,cu evitarea formarii bulelor de aer. Se asteapta 2-3 minute pentru o buna colorare si se utilizeaza obiectivul 40xpentru evidentierea:

-polimorfonucleare > 50/cimp in shigeloze

-polimorfonucleare < 20/cimp in salmoneloze

-polimorfonucleare < 2-5/cimp in EPEC

-polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze

-polimorfonucleare si eritrocite in campilobacterioze

- Coloratia Gram evidentiaza:

-flora Gram-negativa dominanta (bacili) sau bacili/cocobacili foarte fini, incurbati, sub forma de virgula sau picatura(Campylobacter)

-flora Gram-pozitiva : coci Gram pozitivi(posibila infectie cu stafilococ)

C.EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL MATERIILOR FECALE cuprinde etapele de insamintare/imbogatire,cultivare 24 de ore la termostat, in aerobioza,identificarea si testarea senibilitatii la antibiotice.

Proba se insaminteaza ca atare in cazul in care scaunul este lichid, preferindu-se

portiunile bogate in striuri cu mucus si singe. In cazul unui scaun consistent, se

procedeaza la omogenizarea acestuia in mediile de transport in care au fost aduse sau

in 5-7 ml solutie ser fizilogoc steril, Ph 7.Prelucrarea ulterioara este diferentiata in functie

de examenul solicitat(Shigella, Salmonella,etc).

In caz ca nu exista nici o astfel de indicatie, laboratorul are obligatia de a asigura in primul rind diagnosticul pentru Enterobacteriile patogene:Salmonella, Shigella si E.Coli enteropatogen(EPEC)(acesta din urma pentru copii sub 2 ani).Se va evita incarcarea laboratorului cu solicitari pentru alte grupuri de germeni din familia Enterobacterii sau din afara ei, raminind la latitudinea medicului de laborator identificrea si testrea sensibilitatii la antibiotice a unui patogen legat de o situatie clinica particulara(nou nascuti, sugari,dismicrobism bacterian,etc).

Coprocultura pentru germenii din genul Shigella

Probele recoltate in conditiile mai sus amintite, se insaminteaza in mod obligatoriu pe mediul selectiv-diferential ADCL,dispersia facindu-se in asa fel incit sa se obtina colonii separate.Dupa o incubare de 20 ore la 37 grade Celsius sau dupa o incubare prelungita de 48 ore in cazul in care culturile nu sint bine dezvoltate;coloniile suspecte(rotunde, translucide si care nu modifica culoarea mediului, fapt ce se datoreaza lipsei de fermentare a lactozei), se vor repica in mod obligatoriu pe :

geloza Mc Conkey sau AABTL(sector)

pe mediile politrope TSI , MIU,citrat

Se trec cel putin 3-4 colonii suspecte in sector si 1-2 colonii pe mediile politrope, dupa care se incubeaza in aerobioza peste noapte, in incubator, la 37 grade Celsius.Mediile pe care s-au facut repicari, se confrunta cu cresterea bacteriana de pe mediile politrope, concomitent cu reexaminarea culturii originale: orice cultura care nu produce H2S, fermenteaza glucoza,fara producere de gaz, de acid din lactoza -zaharoza iar pe MIU este ureazonegativa , imobila si indol variabila si nu creste pe citrat, este suspecta de a fi Shigella si se aglutineaza cu serurile anti -shigella existente in laborator.

Reactia de aglutinare pe lama se executa cu tulpini dezvoltate pe TSI. Intr-un prim timp

se executa reactia de aglutinare cu ser fiziologic, in vederea selectarii formelor R: rezultatul

trebuie sa fie pozitiv in acest caz.

Urmeaza aglutinarea pe lama cu seruri corespunzatoare celor mai frecvente tipuri de bacili dizenterici din tara noastra(ser polivalent anti Flexneri, ser anti Sonnei S si anti Sonnei R). Orice tulpina pozitiva la aglutinarea cu unul dintre aceste seruri se va trimite la DSP sau la laboratorul de referinta din I.Cantacuzino.

Toate tulpinile Shigella ,identificate preliminar in laboratorul nostru, vor fi testate pentrusensibilitatea la antibiotice.

Coprocultura pentru germenii din genul Salmonella

Probele recoltate in conditiile mai sus amintite, se insaminteaza in mod obligatoriu pe mediul de imbogatire selenit acid de sodiu ,cu trecere ulterioara, dupa minimum 16 ore de incubare la termostat, pe mediul ADCL sau pe mediu Istrate Meitert.Coloniile suspecte(colonii necolorate, cu centru negru, de 1-2 mm pe ADCL, ce pot fi confundate cu coloniile de Proteus1 sau de aceleasi dimensiuni, dar albastre(verzi) si cu centru negru, dezvoltate pe Istrate-Meitert, etalate direct sau dupa imbogatire, se vor repica in sectoare pe mediu McConkey sau AABTL si in mod obligatoriu pe TSI, MIU, citrat.Orice colonie care produce H2S pe TSI, fermenteaza glucoza cu producere de gaz (partea dreapta) si nu produce acid din lactoza-zaharoza, iar pe mediul MIU este ureazonegativa, indolnegativa si mobila, este suspecta de Salmonella.Culturile dezvoltate pe mediul TSI, care produc cantitati minime sau nu produc deloc H2S, care fermenteaza glucoza fara producerede gaz dar avind celelalte caractere similare similare celor mai sus mentionate, sint suspectate a fi Salmonella typfi desemenea si vor fi supuse identificarii serologicein acelasi mod cu tulpinile cu caractere bichimice nete de Salmonella.

Reactia de aglutinare se va efectua initial cu ser fiziologic,pentru a exclude formele R , urmata apoi de aglutinarea cu seruri polivalente anti O si seruri anti Vi ca etapa de screening.Tulpinile ce vor aglutina in etapa de screening, precum si cele banuite a fi Salmonella spp pe baza identificaii biochimice dar care nu au aglutinat cu serurile amintite, vor fi trimise pentru identificare finala la institutul I.C.Toate tulpini;e Salmonella identificate vor fi testate pentru sensibilitatea la antibiotice.

Coprocultura pentru germenii din genul E.Coli Enteropatogen(EPEC)-pentru copii

cu virsta pina la 2 ani.

Probele recoltate in conditiile mai sus amintite, se insaminteaza pe mediile AABTL/Mac Conkey.Dupa incubare 24 ore la termostat, se repica in sectoare 5-10 colonii lactozo-pozitive, pe acelaeasi medii(AABTL/MacConkey) si se face insamintarea pe medii politrope(TSI MIU, citrat).Dupa incubare la termostat timp de 24 ore,se va proceda la aglutinare pe lama cu ser monovalent EPEC, cu cite o colonie din cele 5-10 sectoare. In caz de aglutinare puternica si imediata, se va testa tulpina respectiva pentru sensibilitatea la antibiotice.

Coprocultura pentru Stafilococ auriu(coagulazo-pozitiv)

Probele recoltate in conditiile mai sus amintite se insaminteaza pe geloza -singe si Chapman.Dupa incubare de 24 ore, se apreciaza aspectul cresterii caracteristice pe cele 2 medii de insamintare(beta hemoliza, pigment+/-,fermentarea manitei), se efectueaza testul coagulazei libere/legate sau se testeaza coloniile presupuse a fi stafilococ auriu coagulazo pozitiv cu trusa latex aglutinare             care va cofirma caracterele de patogenitate prezente, respectiv

Se va proceda la testarea sensibilitaii la antibiotice iar tulpinile izolate in eventuale epidemii de toxiinfectii alimentare se vor trimite la I.C. pentru lizotipie.

Antibioticele folosite pentru testarea sensibilitatii in cazul izolarii Salmonella si Shigella spp, prin metoda clasica a antibiogramei difuzimetrice Kirby -Bauer, agar Mueller-Hinton, incubare in aerobioza, 37 grade Celsius,24 de ore, sint urmatoarele:

Ampicilina 10 ug

Ciprofloxacin/Levofloxacin 5 ug

Sulfametazol-Trimetoprim(SXT) 1.25/23.75 ug

Ceftazidim/Cefotaxim 30 ug

Cloramfenicol 30 ug

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL EXUDATULUI FARINGIAN

1. INDICATII : izolarea si identificarea de STREPTOCOC BETA HEMOLITIC (GRUP A,B, C si G) si de STAFILOCOC AURIU COGULAZO-POZITIV (STAPHYLOCOCCUS AUREUS).

2. CULTIVARE :- descarcarea tamponului pe un sector al placii cu mediu agar- sange de berbec 5 % si epuizarea inoculului in striuri cu ansa bacteriologica , pentru obtinerea de colonii izolate .

3. INCUBAREA CULTURILOR : - in termostat paralelipipedic , 18 - 20 h pana la 48 h , la 37 grade C .

4. CITIREA CULTURILOR :

Pentru streptococ se urmareste prezenta de colonii mici( 1mm diam.), transparente sau opace , inconjurate de o zona larga de beta - hemoliza.

Pentru stafilococ se urmareste prezenta de colonii mari, albe sau pigmentate in galben ,de aspect cremos, cu o zona mai mica de beta hemoliza in jur pe geloza -singe si ingalbenirea mediului Chapmann(fermentarea manitei).

5.IDENTIFICARE :

- verificare prin frotiu colorat GRAM a aspectului microscopic caracteristic

( coci , cocoizi GRAM + ) in lanturi lungi pentru Streptococ pyogenes si in lanturi scurte sau in diplo pentru Streptococ beta hemolitic de alte grupe considerate patogene(B,C si G) si coci gram pozitiv dispusi in ciorchine pentru Stafilococ auriu.

Identificarea streptococilor beta-hemolitici:       

a)- testul sensibilitatii la bacitracina pentru diferentierea streptococilor de grup A ( sensibilitate prezenta ) de cei non-A ( sensibilitate absenta)

TEHNICA TESTULUI LA BACITRACINA :

Proba : colonii beta -hemolitice bine izolate pe agar - sange

Necesar : - placi cu agar - sange de berbec

- biodiscuri cu 0.04 U sau 0.1 U bacitracina

Procedura :- se preleva cu ansa 3-4 colonii beta - hemolitice

- se etaleaza pe ¼ din placa de agar - sange in striuri stranse si suprapuse in 3 directii

- se plaseaza in centrul ariei insamantate un disc de bacitracina

- incubare 18 - 20 h la 35- 37 grade C

Citire si interpretare :

a)- test pozitiv = orice zona de inhibitie a cresterii in jurul discului cu 0,04 U bacitracina

= zona de inhibitie cu diametrul > 11 mmin jurul discului de 0,1 U bacitracina

- test negativ = absenta zonei de inhibitie ( disc de 0,04 U )

= inhibitia cresterii < 11 mm ( disc de 0,1 U )

b) -truse latex aglutinare cu respectarea indicatiilor de utilizare ale producatorului

( pentru identificarea celor 6 grupe de streptococi beta hemolitici implicati in patologia umana : A,B,C,D,F,G).

Identificarea stafilococului auriu (coagulazo-pozitiv)

a)- testul coagulazei legate(pe lama) si testul coagulazei libere(in tub)

TEHNICA TESTULUI COAGULAZEI LEGATE/LIBERE

Peste 96 % din tulpinile de S.auriu coaguleaza plasma prin activarea unui factor plasmatic similar trombinei(coagulaza libera) si/sau prin actiunea directa asupra fibrinogenului (coagulaza legata de peretele celular).Obisnuit,cei doi factori coagulanti coexista.

Proba: colonii izolate din cultura pura de 18-24 ore pe mediu neselectiv( nu culturi mixte sau de pe mediu hiperclorurat).

Necesar: Plasma umana oxalata sau pe EDTA,separata prin centrifugare( este contraindicata plasma citratata deoarece organismele care utilizeaza citratul pot da rezultate fals pozitive).

Procedura pentru cogulaza legata:

Se emulsioneaza 1-2 colonii intr-o picatura de apa distilata peo lama de microscop, pentru a obtine osuspensie laptoasa.Daca nu apare o autoaglutinare in 10-20 secunde,se inmoaie un fir in plasma umana EDTA si se agita in suspensia bacteriana.Se urmareste aglutinarea stafilococilor in 15 secunde.

- test pozitiv : aglutinare in 15-20 secunde.

- test negativ: absenta aglutinarii in interval de 2-3 minute.Testul negativ trebuie confirmat prin testul in tub.

Procedura pentru cogulaza libera:

Se repartizeaza 0,5 plasma umana EDTA intr-un tub 10/100 ml steril. Se adauga 0,5 ml din cultura de 24 ore a tulpinii de testat in bulion glucozat. Se amesteca prin rotire sau scuturare usoara a tubuluisi se incubeaza la 37 grade Celsius.

test pozitiv:Coagulare, indiferent de gradul ei(val fin , in masa)

test negativ:Absenta coagularii

Se citeste reactia prin inclinarea tubului la intervale de 30 minute, in primele 4 ore.Tulpinile intens producatoare de coagulaza dau reactii pozitive in 1-4 ore.Cheagul poate fi lizat la scurt timp dupa formare.Alte tulpini dau coagulare tardiva, la 18-20 oresi de aceea, toate testele negative la 4 ore trebuie citite lsi la 24 ore de incubare.

b) -truse latex aglutinare indirecta ce contin fibrinogen si Ig.G si care cupleaza coagulaza legata respectiv proteina A din peretele S.aureus , avand ca expresie macroscopica aglutinarea amestecului dintre reactiv si cultura cercetata .(se respecta indicatiile producatorului din prospectul kitului ).

5. COMUNICAREA REZULTATULUI :

-  Prezent Streptococ beta-hemolitic grup.

-  Absent   Streptococ beta -hemolitic

- Prezent Stafilococ-auriu(coagulazo-pozitiv)

- Absent Stafilococ-auriu(coagulazo-pozitiv)

Stafilococul auriu(coagulzo-pozitiv )este considerat patogen si comunicat ca atare doar in cazul de abces amigdalian sau cind este identificat alaturi de Streptococul beta -hemolitic patogen, intrucit poate fi secretor de beta-lactamaza si astfel eventualul tratament al anginei streptococice cu Penicilina sa nu-si faca efectul scontat

6.ANTIBIOGRAMA

de obicei nu se efectueaza pentru streptococul beta hemolitic de grupa A (Streptococ pyogenes) datorita pastrarii nealterate a sensibilitatii naturale la peniciline. Daca exista pacienti alergici la Penicilina sau Streptococul beta-hemolitic este identificat alaturi de Stafilococ auriu, se poate face antibiograma la cererea expresa a clinicianului. Aceasta cuprinde urmatoarele antibiotice:

Denumire biodisc	Concentratie/biodisc	rezistent	intermediar	sensibil
Penicilina	10 UI	-	-	> 24
Ampicilina	10 ug	-	- Proiect: Lipidele - activitatea biologica a acizilor grasi, grasimile Proiect: 5 motive sa bei cat mai multa limonada	> 24
Eritromicina	15 ug	< 15		>21
Clindamicina	2 ug	<15		> 19
Cefepim/Cefotaxim/Ceftriaxon	30 ug	-	-	> 24
Vancomicina	30 ug	-	-	> 17

Pentru Stafilococ auriu(coagulazo-pozitiv) se folosesc urmatoarele antibiotice pentru antibiograma difuzimetrica:

B.DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL NAZOFARINGITEI STAFILOCOCICE :

1. INDICATII : depistarea portajului de STAFILOCOC AURIU COGULAZO-POZITIV (STAPHYLOCOCCUS AUREUS).

2. CULTIVARE : descarcarea tamponului pe un sector al placii cu mediu agar- sange de berbec 5 % si pe mediu hiperclorurat solid CHAPMAN cu epuizarea inoculului in striuri cu ansa bacteriologica , pentru obtinerea de colonii izolate .

3. INCUBAREA CULTURILOR : - in termostat paralelipipedic , 18 - 20 h la 37 grade C .

4. CITIREA CULTURILOR : aparitia de colonii caracteristice mari cu diametrul de 1-2 mm , rotunde , tip S, bombate- pe agar-sange frecvent hemolitice

- pe mediu CHAPMAN solid colonii galbene , cu halou galben

5. IDENTIFICARE RAPIDA A SPECIEI S. AUREUS

- truse cu reactivi comerciali de aglutinare indirecta ce contin fibrinogen si Ig.G si care cupleaza coagulaza legata respectiv proteina A din peretele S.aureus , avand ca expresie macroscopica aglutinarea amestecului dintre reactiv si cultura cercetata .(se respecta indicatiile producatorului din prospectul kitului ).

6. TESTAREA SENSIBILITATII LA ANTIBIOTICE (ANTIBIOGRAMA) - Metoda Difuzimetrica

a) materiale necesare 

- o placa cu mediu MULLER- HINTON

- bulion nutritiv

- anse sterile

- eprubete sterile, din plastic , cu dop, de 10 ml

- tampon steril

- biodiscuri cu antibiotice din trusa pentru infectii stafilococice

- dispenser pentru repartizarea automata a biodiscurilor pe placa cu mediu

b) tehnica :

- prepararea inoculului:se preleveaza 3-5 colonii similare cu ansa bacteriologica si se descarca in 4-5ml bulion nutritiv turnat in mod aseptic in eprubeta sterila, din plastic, cu dop, de 10 ml.

- se incubeaza inoculul la 37 grade C 2-6 h , pana dezvolta o turbiditate de 0.5 unitati Mc Farland ( turbiditatea standard ) masurata (si eventual ajustata cu bulion nutritiv ) pe nefelometru automat.

- inocularea placii se va face in maxim 15 min dupa obtinerea inoculului standard prin stergerea suprafetei placii cu agar MULLER - HINTON in 3 directii rotind placa cu 60 grade intre aplicari.

- se asteapta maxim 15 min pentru uscarea suprafetei mediului cu placa la adapostul flacarii de gaz si capacul semiinchis.

- se aplica biodiscurile din trusa pentru infectii stafilococice cu aplicatorul automat .

- se preseaza usor fiecare biodisc cu o pensa pentru o mai buna priza la mediu a acestuia si se introduc in termostat cu capacul in jos .

- se incubeaza la 37 grade C timp de 16-18 h dupa care se masoara diametrele zonelor de inhibitie a cresterii bacteriene din jurul biodiscurilor

- interpretarea se face conform tabelului :

7. COMUNICAREA REZULTATULUI : contine germenele izolat, identificat si testarea

susceptibilitatii la antibiotice .

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SECRETIEI OTICE

SECRETIA OTICA DIN URECHEA MEDIE :

- se urmareste izolarea , identificarea si testarea sesibilitatii la antibiotice pentru germeni frecvent intalniti si cu crestere buna pe medii de cultura uzuale :

- Pneumococ (Streptococcus pneumoniae)

- Streptococ beta-hemolitic grup A(Streptococcus pyogenes)

- Stafilococ auriu coagulazo-pozitiv (Staphylococcus aureus)

- Enterobacterii

- se recolteaza cu tampon fin , steril ghidat prin specul auricular catre fistula timpanului

SECRETIA OTICA DIN URECHEA EXTERNA:  

- se urmareste izolarea , identificarea si testarea sensibilitatii la antibiotice pentru germeni frecvent intalniti si cu crestere buna pe medii de cultura uzuale :

-Pseudomonas spp( Pseudomonas aeruginosa)

- Stafilococ auriu coagulazo-pozitiv (Staphylococcus aureus)

- se recolteaza cu un tampon fin , steril din conductul auditiv extern

examen de laborator - examen microscopic colorat GRAM

- epuizarea tampoanelor pe - o placa agar-sange

- o placa mediu CHAPMAN solid

- o placa mediu selectiv lactozat MACCONKEY (pentru bacilii GRAM negativi")

- incubare 18 - 20 h la 37 grade C

- citirea probelor si introducerea izolatelor in algoritmul de identificare si antibiograma mentionat mai sus .

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SECRETIEI CONJUNCTIVALE

- se urmareste izolarea , identificarea si testarea susceptibilitsatii la antibiotice pentru germeni implicati in patologia oculara , fara exigente deosebite de crestere :

- Stafilococ auriu coagulazo-pozitiv (Staphylococcus aureus)

- Streptococ beta hemolotic grup A (pyogenes)

- Enterobacterii

- Pseudomonas spp(Pseudomonas aeruginosa)

- Candida spp

- prelevarea probelor - se face dupa toaleta fetei cu un tampon steril fin confectionat   din vata hidrofoba pentru efectuarea de culturi pe mediu -agar-sange aerob

- CHAPMAN solid

- Mac Conkey

- Sabouraud

- prelevare pentru examen microscopic colorat

- GRAM : aprecierea reactiei inflamatorii , numarul si morfotinctorialitatea bacteriilor

-GIEMSA : aprecierea morfologica a celulelor epiteliale , prezenta polimorfonuclearelor neutrofile

(conjunctivita bacteriana acuta), prezenta limfocitelor si macrofagelor (conjunctivite bacteriene cronice , conjunctivite virale), PMN neutrofile si eozinofile( conjunctivite alergice)

-incubare 18-20-48 h

-citirea culturilor

- algoritm de identificare pentru- S.aureus

- Pseudomonas aeruginosa

- fungi

UROCULTURA

Indicata pentru diagnosticul etiologic al infectiilor urinare cu germeni frecvent incriminati ca etiologie: E.COLI, KLEBSIELLA spp., PROTEUS spp., ENTEROBACTER spp., PSEUDOMONAS spp., STAPHYLOCOCCUS AUREUS.

2.EXAMENUL CITO-BACTERIOLOGIC UZUAL AL URINII :

a) examen microscopic al sedimentului urinar -preparat umed :

- in eprubeta de centrifuga cu capac se pun 8 ml urina ,

- se centrifugheaza 5 min la 3000 tur./min

- se arunca 7.2 ml de urina , se resuspensioneaza 0.8 ml urina ramasa

- se depune pe o lama port-obiect o picatura de urina , se acopera cu o lamela de sticla

- se examineaza la microscopul optic cu obiectiv 10X

- se apreciaza prezenta elementelor tisulare, sanguine( leucocite , hematii ) , a cilindrilor urinari, a cristalelor urinare, levurilor, aTrichomonas vaginalis, bacterii .

- indicat pentru triajul de calitate al probelor pentru urocultura cantitativa .

b) examen microscopic colorat GRAM din sediment urinar - optional

3. UROCULTURA CANTITATIVA CU ANSA CALIBRATA

- necesar pentru o proba : - ansa calibrata de unica folosinta ,sterila, cu diametru de 0,001 ml

- o placa cu agar- sange de berbec 5 %

- o placa cu mediu slab selectiv : Mac Conkey,AABTL

- procedura: - se resuspensioneaza restul de urina din recipientul de recoltare,

- se imerseaza ansa imediat sub nivelul fluidului si se imprima cateva miscari pe verticala in sus si in jos,

- se retrage ansa din fluid in pozitie verticala si cu viteza moderata a miscarii ,

- se descarca ansa in striu pe unul din diametrele placii cu mediu agarizat si se epuizeaza imediat inoculul pe toata suprafata placii in striuri stanse perpendiculare pe striul de descarcare

- se incubeaza placile 18-20 h la 37 grade C, in aerobioza.

4. CITIREA UROCULTURII CANTITATIVE

-identificarea coloniilor pe agar sange si mediu Mac Conkey

- colonii S , alb cenusii, cu sau fara hemoliza, colonii lactozo pozitive pe medii selective>>>>se continua identificarea pentru enterobacterii conform algoritmului de identificare mentionat mai sus.

- colonii S , mari , pigmentate , cu hemoliza beta, cu crestere slaba pe medii diferentiale >>>>se continua identificarea pentru Staphylococcus aureus conform algoritmuluide identificare mentionat mai sus.

-determinarea UFC/ml dupa formula :

X= NxDx 1/ volum insamantat

-colonii mici ,lactozo positive ,aderente la mediu ce degaja un miros caracteristic de flori de tei pe mediu Mac Conkey si colonii puternic hemolitice pe agar - sange , testul oxidazei si testul catalazei pozitive caracteristice speciei Pseudomonas aeruginosa.

Unde X = numarul de UFC/ml urina

N= numarul de colonii pe placa

D= factorul de dilutie ( inversul dilutiei )

5. ANTIBIOGRAMA (Metoda Difuzimetrica) !!! se efectueaza pentru orice germen izolat si identificat .

- tehnica este descrisa mai sus

- se folosesc biodiscurile din trusa de infectii urinare conform tabelului :

6. COMUNICAREA REZULTATULUI :

-cuprinde datele de identificare personala ale pacientului , din registrul de lucru , exprimarea cantitativa a incarcaturii bacteriene urinare , rezultatul antibiogramei , semnatura celui care a efectuat analiza .

EXAMEN BACTERIOLOGIC AL PUROIULUI

1. DEFINITIE : puroiul este un exudat fibrinos , uneori sanghinolent , care cotine leucocite

(predominent polimorfonucleare neutrofile , in inflamatiile acute sau mononucleare , in inflamatiile cronice specifice) , resturi celulare si microorganisme determinante .

2. PRELEVAREA PUROIULUI :

a)prelevare din colectii inchise : se aspira puroiul cu un ac suficient de gros adaptat la o seringa etansa

b)prelevare din plagi infectate superficiale cutanate : se face cu tampon steril impregnat cu solutie Ringer ce se roteste cu varful timp de 5 sec. pe o arie de cca. 1 cm² .

3. EXAMEN MACROSCOPIC :

- se consemneaza   - mirosul

- culoarea

- consistenta

4. EXAMEN MICROSCOPIC :

frotiu colorat GRAM : informatii despre incarcatura bacteriana , tinctorialitatea acesteia

(GRAM +sau -) , categorii de leucocite (PMN,limfocite ,macrofage)

5. CULTIVAREA PROBELOR :

- pentru bacterii aerobe cu crestere rapida- o placa agar - sange de berbec 5%

- o placa cu agar Mac Conkey

- o placa cu mediu hiperclorurat solid Chapman

- pentru fungi - o placa cu mediu Sabouraud

6. INCUBAREA : se incubeaza aerob la 37 grade C 20- 48 h

7. CITIREA CULTURILOR : se repica coloniile care au semnificatie diagnostica in contextul clinic si al examenului microscopic colorat GRAM in vederea efectuarii antibiogramei si a identificarii dupa algoritmurile enumerate mai sus.

CULTURA DIN SECRETIE VAGINALA

1. PRELEVAREA PROBEI: secretia acumulata in fundul de sac posterior este detasata cu

ajutorul uneia din cele doua valve sterile introduse in vagin si recoltata pe trei tampoane

destinate examenului microbiologic.

2. DETERMINARI CHIMICE :

- se efectueaza direct pe valva ginecologica

- determinarea pH-ului cu ajutorul hartiei indicator ( pH>5 sugestiv pentru infectia cu trichomonas

vaginalis si vaginoze)

- testul aminelor volatile ( whiff test ) prin depunerea a cateva picaturi de sol. KOH 10 % pe

secretia vaginala de pe suprafata valvei si in caz de vaginoza se degaja imediat un miros

neplacut de peste alterat.

3. DESTINATIA CELOR TREI TAMPOANE :

- tamponul 1 se descarca in 0.5 ml solutie salina izotona sterila iar din omogenat se efectueaza un preparat proaspat intre lama si lamela care se examineaza la microscop cu obiectiv 10 X si 40 X , obtinand urmatoarele informatii : reactie inflamatorie intensa in trichomonaza, reactie mai discreta in candidoza si de regula absenta in vaginoza.

- depistarea T. Vaginalis

- prezenta fungilor

- tamponul 2 se efectueaza un frotiu colorat GRAM ce apreciaza mai exact flora bacteriana

vaginala si un frotiu colorat Giemsa pentru citologie vaginala .

- tamponul 3 se descarca pe placi cu medii de cultura Sabouraud, agar- sange, agar ABTL, pentru izolare fungi, Streptococcus pyogenes, bacili gram negativi .

4. CITIREA CULTURILOR in vederea stabilirii tipului de algoritm de identificare si /sau

efectuarea de antibiograma.

5. COMUNICAREA REZULTATULUI prin coroborarea datelor de laborator ( microscopice si de

cultura ).

6. Prelucrarea si exprimarea rezultatelor:

Exprimarea determinarilor microbiologice se face in PREZENT sau ABSENT pentru culturi si SENSIBIL, INTERMEDIAR SENSIBIL sau REZISTENT pentru antibiograma.

Interpretarea de laborator: Numarul, aspectul coloniilor si aspectul mediilor dau diagnosticul de gen. Fiind vorba de o dubla difuzie in gel, diametrul zonelor de inhibitie, in functie de genul bacterian, de structura si concentratia antibioticului pe comprimat, releva sensibilitatea la agentul terapeutic (gradul de inhibare a cresterii bacteriene). Interpretarea semnificatiei diametrelor in functie de genul agentului etiologic si de concentratia pe comprimat este bine stabilita de centre/organisme mondiale de referinta (NCCLS de exemplu), respectate si reamintite in prospect pentru fiecare produs (microcomprimat de antibiograma) de catre producator. Deoarece interpretarea este foarte laborioasa pentru un medic nespecialist (de laborator) care ar trebui teoretic sa dispuna de tabele si sa le si consulte, in ciuda normelor DSP care permit comunicarea directa a diametrului inhibitiei, laboratorul nostru prefera comunicarea ca rezultat final a interpretarii din tabele si incadrarea germenelui ca sensibil, intermediar sensibil sau rezistent.

Intervale biologice de referinta: nu este cazul

Specificatii de performanta: Existenta unui tropism al bacteriilor pentru diferite localizari, tablourile clinice suficient de sugestive pentru fiecare etiologie bacteriana / micotica, varietatea mediilor de cultura, destinatia lor bine definita precum si etapele clare care trebuiesc urmate formeaza un algoritm cu inalta specificitate si foarte rare posibilitati de eroare sau confuzie.

Potentiale surse de variabilitate :

- Recoltarea, transportul si manevrarea incorecta a inoculului pot duce de la absenta germenului in inoculul final pana la contaminarea probei cu flora saprofita (care face diagnosticul final dificil daca nu chiar imposibil).

- Incubarea incorecta (ca timp) a mediilor insamantate.

Inregistrarea rezultatelor.

Rezultatele sunt inregistrate si prezentate in registrul de microbiologie si in registrul de evidenta a pacientilor, unde executantul inregistreaza:

-data primirii probei;

-toate incercarile;

-rezultatele finale indicate de aparate sau calculate de executant.

Examenul macroscopic al materiilor fecale

Materiile fecale se examineaza direct cu ochiul liber sau cu lupa pentru a putea distinge paraziti intestinali intregi sau fragmente (proglote de tenii), striuri de singe, fragmente de mucoasa.

Se apreciaza aspectul scaunului :

-culoare

-consistenta

-elemente patologice

-mucus

-striuri sanguine

-reziduuri nedigerate

6.7.1 Examenul microscopic

Preparatele directe sunt usor de realizat si ofera rezultate bune in depistarea chistilor de protozoare, oualelor de helminti si totodata ofera date asupra digestiei.

preparatul direct in ser fiziologic: pe o lama se pune o picatura de ser fiziologic. Se preleveaza o mica cantitate de materii fecale din recoltor, din mai multe portiuni ale bolului fecal cu ajutorul unei spatule fine si omogenizeaza in serul fiziologic. Se acopera cu o lamela cu latura mai mica decat latimea lamei, pentru ca preparatul sa nu depaseasca marginile lamelei.

Preparatul este corect efectuat daca, asezat pe un ziar , literele tiparite se vad prin transparenta. Se examineaza la microscop cu obiectivul X 20, X 40. Se pot identifica : chisti de protozoare, oua de helminti.

preparatul in solutie Lugol : Lugolul coloreaza chistii de protozoare si oualele de helminti in brun, a caror detalii de structura interioara devin nete.Totodata ofera posibilitatea de a decela amidonul ne - sau semidigerat. Dupa omogenizare cu solutia Lugol se acopera preparatul cu o lamela si se examineaza la microscop cu obiectivul X 20, X 40.

Se inregistreaza in registrul analizelor parazitii identificati dupa examinare macro si microscopica si se noteaza prezenta si frecventa lor.

Dupa examinarea microscopica lamele si lamelele se inactiveaza in solutie dezinfectanta dupa care se autoclaveaza 30 de minute la 134^o C (2 atm).

Coprorecoltoarele din plastic utilizate se strang in saci galbeni sau albi inscriptionati cu pictograma "Pericol biologic' in vederea incinerarii.

Interpretare rezultate

Pentru efectuarea unei identificarii definitive, este nevoie de corelarea a trei examinari consecutive, spatiate de un interval de 2-3 zile. Datele se inregistreaza in SIL

Rezultatul este dat de identificarea formelor intestinale chisti sau oua de paraziti, elemente adulte sau proglote si se noteaza prezenta si frecventa lor.

Surse de eroare:

- probele vechi;

Cap.7.Responsabilitati

7.1. Responsabilul de analiza raspunde de executarea corecta ,conform prezentei proceduri, a operatiei de efectuare a determinarilor microbiologice.

7.2. Responsabilul de analiza /proces trebuie sa verifice rezultatul analizelor si sa autorizeze eliberarea acestora (prin semnatura in Registrul de microbiologie

Cap.8. Inregistrari

- registrul de microbiologie

- registrul de analize

- buletin de analiza