Multiplicarea in vitro

Multiplicarea in vitro

A.    Notiuni introductive   

Multiplicarea asexuata (vegetativa), sau propagare in vitro este inmultirea unei plante dintr-un organ vegetativ (tulpina, radacina, frunza, mugure), care are ca rezultat formarea de noi plante. Acest tip de inmultire este opusul multiplicarii sexuate (care implica unirea gametilor de sex opus) din organul de reproducere si care are ca rezultat formarea de fructe si seminte.

Prin multiplicare asexuata se obtine o clona. Clona este, conform dictionarului enciclopedic roman, totalitatea indivizilor proveniti dintr-un singur individ, obtinuti pe cale vegetativa sau asexuata. In horticultura se  practica inmultirea de acest fel, pornindu-se de la un singur lastar, de la o singura mutatie gasita pe ramura unei plante, sau dintr-o singura mutanta obtinuta artificial de ameliorator, sau genetician. Asadar, toate plantele obtinute prin multiplicare vegetativa, dintr-un singur lastar, organ, sau soi (genotip), poarta numele de clona.

Inmultirea in vitro a plantelor poarta denumirea de micro-propagare, micro-multiplicare sau micro-inmultite este un tip special de inmultire asexuata in care un fragment foarte mic de tesut (apex de lastar, portiune de frunza, de tulpina) este excizat si pus intr-un tub, sau vas de cultura, sau cutie Petri care contine un mediu de cultura special. Acest mediu de cultura contine un amestec adecvat de nutrienti, zahar, vitamine si hormoni si asigura suportul nutritiv pentru cresterea explantului, dezvoltarea acestuia si obtinerea de noi plantule. De ex: dintr-un apex de crizantema, pe un mediu adecvat, se pot obtine intr-un an pana la 1.000.000 de noi plantule. Cu alte cuvinte, cultura de tesuturi se foloseste pentru inmultirea rapida la plante.

Multiplicarea in vitro este aplicata la plante in scopul asigurarii obtinererii unui randament superior de multiplicare vegetativa, comparativ cu metoda clasica de inmultire vegetativa, sau alte procedee practicate.

Explantul, adesea denumit si propagul este o portiune de tulpina, radacina, ovul, antera, sau frunza, adica un organ sau tesut vegetal desprins de la planta donor. In conditiile favorabile asigurate de cultura in vitro, sunt declansate procesele de  regenerare de lastari, sau radacini adventive. Rezultatul este formarea unei noi plantule identice cu planta de origine. Fragmentele de tulpina trebuie sa formeze radacini adventive (pentru ca au deja lastari), fragmentele de radacina trebuie sa formeze lastari adventivi (pentru ca poseda deja radacini), iar fragmentele de frunza trebuie sa formeze atat lastari adventivi, cat si radacini adventive. Ca urmare in compozitia mediului de cultura trebuie sa intre in mod obligatoriu hormoni adecvati cu tipul de diferentiere necesar, sau tipul de structuri adventive care trebuie sa se formeze.

Tipul de explante utilizate la micro-propagare

Frunza - trebuie sa formeze lastari si radacini adventive, cu exceptia utilizarii mugurilor de la baza frunzelor a) mugure foliar b) petiol de frunza c) lamina frunzei d) fragmente de frunza Tulpina trebuie sa formeze radacini adventive a) lastar lignificat b) lastar cu frunze c) lemn tanar d) structuri ierboase e) coarda     tulpina fara frunze    f) rizomi     radacini subterane   g) tuberculi tulpini subterane cu rezerve tubercul Radacina trebuie sa formeze lastari adventivi portiune de radacina radacina tuberoasa

Deoarece la inmultirea vegetativa se doreste obtinerea de indivizi identici cu planta donor de material vegetal, pentru micro-propagare niciodata nu trebuie sa se utilizeze ca explant structurile cu variegare, sau himerele.

Chimera este o planta, sau un complex structural alcatuit din straturi genetic diferite, care pot fi diferite prin cantitatea de informatie genetica (numarul de cromozomi, sau de genomuri), sau prin modul de exprimare al acestei informatii. Cel mai comun exemplu de chimera este 'variegarea' la plante, care se caracterizeaza prin alternanta de regiuni, sau straturi ale frunzei de culoare verde, cu cele de culoare alba in care este absenta clorofila.

Acestea se mai numesc si mutante clorofiliene.

Meristemele, structurile din care se realizeaza multiplicarea asexuata, sunt alcatuite din 3 straturi histologice denumite L I, L II si L III, din care iau nastere si se diferentiaza in noua plantula urmatoarele structuri:

Stratul histologic	Da nastere la:
L I	Epiderma tuturor organelor;  Lucrare: Maduva spinarii - sectiune transversala prin maduva spinarii Referat: Subcuctisul - hipodermul - retea bogata de fibre de colagen si elastice
L II	La nivelul tulpinii si radacinilor da nastere la: cortexul intern si extern, cilindrul central La nivelul frunzelor da nastere la mezofilul din zonele laterale ale frunzelor
L III	La nivelul tulpinii si radacinilor da nastere la: cortexul intern, vasele libero-lemnoase si maduva   La nivelul frunzelor da nastere la mezofilul din zona centrala a frunzelor
Daca aceste straturi histologice ale meristemului initial sunt alcatuite din celule cu grad diferit de ploidie, sau celule in care difera informatia genetica ca urmare a unor mutatii, noua plantula care se va forma prin inmultire asexuata va fi constituita din tesuturi cu informatie genetica diferita. Astfel de plante se numesc himere. De exemplu, la Elaeagnus (planta ornamentala), acest aspect de variegare este foarte des intalnit si se manifesta prin frunze care au aspect variegat ca urmare a zonelor de frunza fara clorofila. Nuantele diferite de verde sunt determinate de grosimea stratului de celule cu clorofila.

Locarizarea straturilor histologice la Dicotiledonate

Daca se utilizeaza la cultura in vitro aceste fragmente de frunza cu variegare, plantulele care se vor forma nu vor fi niciodata la fel cu planta cu variegate din care s-au detasat explantele. Motivul este simplu: lastarii adventivi care se formeaza vor avea proprietatile regiunii de frunza din care au regenerat. Acelasi lucru s-ar intampla in cazul fragmentelor de tulpina sau radacina provenite de la o planta cu variegare histologica. Din acest motiv, chimerele nu se inmultesc prin fragmente (butasi), sau prin metode care implica formarea de lastari adventivi, pentru ca niciodata nu vor rezulta la plantule 'true to type'. 

CONCLUZIE

Multiplicarea in vitro, sau multiplicarea clonala, sau micro-propagarea este un tip de inmultire vegetativa, in care, in conditii favorabile de cultura, dintr-un explant (propagul) regenereaza structuri adventive si rezulta plante identice ('true to type') cu planta din care a provinit explantul.

B.    Protocol uzual pentru multiplicarea clonala in vitro

b.1. Explantul

Pentru multiplicarea in vitro la plante se folosesc explante care contin structuri meristematice, sau cu potential meristematic caracterizate prin capacitatea de diviziune activa a celulelor. Aceste explante pot fi reprezentate prin:

s organe, sau fragmente de organe: flori, muguri, frunze, ovare, antere

s tesuturi meristematice primare (caulinare si radiculare), secundare (cambiul, meristemele parenchimului medular, meristemele intercalare) din diferite tesuturi

s calus (mase de celule nediferentiate)

s celule (suspensii celulare, sau celule regenerate din protoplasti)

Micro-propagarea implica formarea de structuri adventive din tesuturi meristematice, sau cu potential meristematic. Un meristem apical caulinar este structurat astfel:

s zona apicala formata de celule cu activitate mitotica redusa

s zona laterala formata de celule cu activitate mitotica intensa care genereaza primordiile foliare

s primordii foliare

s zona axilara situata la baza primordiilor foliare

s zona medulara, histogena care genereaza celulele maduvei

s procambiul plasat sub domul apical, care da nastere tesuturilor conducatoare floem si xilem

Termenul de meristem caulinar se refera la explantul constituit din domul apical si un numar minim de primordii foliare. Tesuturile meristematice se folosesc cu precadere pentru multiplicare in vitro datorita faptului ca acest tip de tesut isi pastreaza capacitatea de diviziune pe tot parcursul vietii plantei.

In stadiile timpurii de dezvoltare ale embrionului plantei, toate celulele se divid rapid. Ulterior, pe parcursul cresterii si dezvoltarii, diviziunea celulara si multiplicarea devin restrictive la anumite zone ale plantei, acolo unde tesuturile pastreaza caracter embrionar, au capacitate ridicata de diviziune a celulelor componente si se caracterizeaza prin diferentiere foarte scazuta. Aceste tesuturi embrionare din corpul unei plante mature se numesc meristeme. Celulele meristematice se caracterizeaza prin: perete celular subtire, forma izodiametrica si continut ridicat de structuri citoplasmatice (organite celulare).

Toate plantele au meristeme, acestea reprezentand locurile de crestere si de origine a diferentierii. Diferentierea este procesul prin care celulele devin specializate pentru indeplinirea unei anumite functii.

b.2. Modele de regenerare si etapele diferentierii din structuri meristematice 

Pe langa existenta meristemelor propriu-zise, plantele prezinta doua caracteristici importante, anume:

s au capacitatea de a forma meristeme din tesuturi de-diferentiate (calusuri)

s celulelor somatice au capacitatea de a evolua intr-un mod similar zigotilor (embriogeneza somatica).

De aceea, la plante prin micro-propagare, in conditii de cultura adecvate se pot obtine noi plantule prin:

inducerea si accelerarea proliferarii meristemelor apicale si a celor din mugurii caulinari si axilari, numita si cultura de meristeme

inducerea formarii mugurilor adventivi direct pe explant (tulpina, frunza, petiol), numita organogeneza directa, sau formarea de muguri adventivi in mod indirect prin trecere printr-o faza intermediara de calus, numita organogeneza indirecta

inducerea diferentierii de embrioni somatici din celulele somatice care intra in alcatuirea organelor, sau a fragmentelor de organe, sau a tesuturilor utilizate ca explant - embriogeneza somatica.

In cazul in care trebuie sa fie initiata o cultura de meristeme apicale sau axilare, se utilizeaza material vegetal recoltat de la plante ex vitro, iar sterilizarea este obligatorie. Daca multiplicarea implica organogeneza adventiva sau embriogeneza somatica, la initiere se utilizeaza adesea material vegetal existent deja  in vitro si nu implica sterilizarea.

Particularitati ale tehnicilor de micro-propagare in vitro

Durata culturii de la initiere la trecerea ex vitro a clonelor obtinute difera in functie de tipul de explant. In general, comparativ cu o cultura de meristem care necesita aproximativ 4 luni de cultura, organogeneza necesita o durata mai scurta, iar embriogeneza o durata mai lunga de timp. In plus, diferentierile indirecte necesita intotdeauna o durata mai lunga comparativ cu diferentierile directe de structuri organogene, sau embrioni.

Complexitatea mediilor de cultura, numarul de transferuri a explantelor necesare pana la obtinerea plantulelor intregi si durata de cultura, sunt principalii indicatori pentru marirea pretului de cost al plantelor obtinute.

Tipuri de culturi pentru multiplicare

Dom meristematic

Organogeneza directa Embriogeneza somatica

C.    Aplicatii ale multiplicarii in vitro

Obtinerea de plante libere de virusuri prin cultura de meristeme este utilizata in cazul:

s soiurilor (genotipurilor) cultivate, valoroase si obtinute in scop comercial

s genotipurilor de plante pe cale de disparitie, in vederea conservarii in banci de gene, sau germoplasma

s devirozarea este conditie obligatorie a garantarii starii fitosanitare pentru materialului genetic din orice sursa de germoplasma

In vederea obtinerii de material biologic liber de principalii agenti patogeni, utilizat ca material vegetal initial pentru infiintarea culturilor, recoltarea de material vegetal pentru initierea culturilor se face numai de la plante supuse initial unui tratament termic la 38sC pe o durata de minim 3 saptamani.

Pe durata culturii in vitro, la plantele transferate ex vitro si la cele transferate pe sol la locul definitiv, trebuie sa se efectueze periodic teste pentru confirmarea statutului de planta libera de virus. 

Producerea de plante libere de bacterii si ciuperci. Prin cultura de meristeme pot fi eliminate cele mai daunatoare genuri de bacterii la plante: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus. Similar, cultura de meristeme este utilizata pentru obtinerea de plante libere de fungi patogeni din genurile: Fusarium, Verticillum, Phialophora si Rhizoctonia.

Multiplicarea in regim industrial si programat a plantelor ornamentale, independent de anotimp, depasindu-se barierele determinate de latenta semintei. Conditiile artificiale de cultura in vitro asigura continuarea proceselor biologice independent de anotimp si la o rata de multiplicare foarte buna.

De exemplu la cartof:

- prin metoda traditionala se obtine o rata de multiplicare  de 60 ori/ an, comparativ cu metoda de micro-propagare, cu care se obtine o rata de multiplicare de 80 ori / la fiecare 40 zile (60 cartofi din 1 prin metoda clasica - 167.772.167 cartofi din 1 prin multiplicare in vitro)

- La garoafa: intr-un  sezon se pot recolta de la o planta pana la 20 butasi/an, comparativ cu o micro-plantula de la care se pot obtine pana la 50.000 descendenti.

Cultura in vitro ofera posibilitatea stocarii, respectiv conservarii materialului vegetal, in volum mic pe termen mediu si lung.

a.     La frigider, la 4⁰C se pot mentine clonele in vase de cultura timp de 3-9 luni;

b.     in congelatoare culturile de embrioni somatici ca atare, sau ca seminte artificiale, se pot pastra practic timp nelimitat.

Materialul biologic este scos la cerere din conditiile de conservare si apoi  utilizat in operatiunile de micro-propagare. Astfel se asigura la comanda un anumit genotip.

Asigurarea unui regim programat al muncii si unei eficiente economice mari in obtinerea plantelor ornamentale autentificate si garantate din punct de vedere al sarii lor fitosanitare. Controlul parametrilor de lucru, al randamentului muncii operatorilor asigura programarea eficienta a activitatilor, astfel incat pretul/planta sa fie cat mai avantajos pentru producator.

D. Avantajele micro-propagarii comparativ cu metodele de inmultire conventionale

snecesita un numar mic de plante si explante

s anual, pe un m.p. de etajera se pot obtine mii de plante (35.000 la speciile lemnoase, 150.000 la plantele erbacee)

s rata mare de multiplicare permite schimbarea sortimentului de material vegetal cu care se lucreaza pe durata unui an

s desfasurarea activitatii se poate realiza fara intrerupere

s materialul obtinut poate fi foarte usor transportat la distante mari in cutii sau saci de plastic, iar greutatea coletelor este mica. De exemplu 40.000 plante cu radacini cantaresc pana la 15 kg

s volumul mic al plantelor multiplicate este foarte avantajos pentru pastrarea vaselor de cultura de durata de luni si ani in frigidere, constituind un stoc de clone. De exemplu intr-un frigider cu capacitate de 200 l se pot conserva cateva mii de plantule

s permite multiplicarea speciilor foarte rare, pe cale de disparitie, sau cu areal redus de raspandire, a celor cu probleme la germinarea semintelor, sau care nu se pot inmulti prin metodele traditionale.

E. Riscurile micro-propagarii in vitro la plante

In cazul multiplicarii in regim industrial a plantelor, pot aparea o serie de aspecte negative cum ar fi:

s eliberarea pe piata (la cerere) a unui numar foarte mare de plante apartinand aceleiasi clone, ceea ce ar insemna saturarea pietei cu produsul respectiv si scaderea cererii pentru sezonul urmator

s raspandirea in cultura a unui numar redus de clone, sau extinderea de monoculturi, duce in timp la o saracire genetica si la scaderea diversitatii genetice a speciilor, cu consecinte foarte grave pentru mentinerea echilibrului biologic

s riscuri determinate de pierderi pe parcursul derularii activitatii ca urmare a vitrifierii, sau necrozarii explantelor, a problemelor tehnice, sau a lipsei de profesionalism al operatorilor

s riscul eliberarii pe piata, sau introducerea in cultura a plantelor cu diferite modificari genetice. Uniformitatea genetic a plantelor este esentiala si poate fi asigurata numai daca se efectueaza:

controlul riguros al tipului de explant transferat la fiecare pasaj, ceea ce impune o buna experienta a personalului operator

si controlul numarului de transferari a explantelor pentru multiplicare, care nu trebuie niciodata sa fie mai mare de 5 pasaje.