Culturi celulare - consideratii de manipulare si siguranta, metode folosite in mod curent pentru cultura de celule

Culturi celulare

Consideratii de manipulare si siguranta

Cand se lucreaza cu material potential daunator, este important sa fim constienti de riscurile posibile asociate atat cu materialul cat si cu protocolul experimental. Toate culturile celulare sunt considerate periculoase datorita potentialului lor de a purta un agent infectios ca de exemplu un virus. Gradul de pericol depinde de celulele ce urmeaza a fi folosite in protocolul experimental. Culturile celulare primare in particular ar trebui manipulate cu grija deoarece aceste culturi prezinta un risc inalt de a contine virusuri nedetectate. Desi liniile celulare folosite in mod obisnuit sunt presupuse in general a fi lipsite de agenti infectiosi trebuie acordata o atentie speciala cand se lucreaza cu aceste linii celulare deoarece este posibil ca ele sa contina agenti infectiosi ca de exemplu virusuri latente. Culturile celulare folosite pentru a studia virusuri specifice au un anumit grad de risc datorita virusului aflat in studiu.

Se recomanda manipularea tuturor materialelor ca potential infectioase pentru a asigura cel mai sigur mediu de lucru posibil. Activitatile trebuie realizate intr-o hota cu flux laminar in conditii aseptice si trebuie evitata crearea de aerosoli. Dupa ce activitatile au fost terminate, toate mediile si echipamentul folosite (de exemplu flacoane, pipete folosite, etc.) trebuie sa fie dezinfectate prin autoclavare sau imersie intr-un dezinfectant. Inainte de a lucra cu tesuturi umane sau animale (de exemplu pentru a stabiliza o cultura celulara primara), este necesar a ne asigura ca sunt respectate regulile de etica medicala si legislatia si standardele experimentelor cu animale. Ar putea fi necesar sa se solicite aprobarea de la autoritati avizate.

Tehnica aseptica si minimizarea aerosolilor

Tehnica aseptica si folosirea corespunzatoare a echipamentului de laborator sunt esentiale cand se lucreaza cu culture celulare. Intotdeauna se folosesc echipament si reactivi sterili si maini spalate. Trebuie evitata formarea de aerosoli. Aerosolii reprezinta un risc de inhalare si pot conduce la contaminarea incrucisata intre culturi. Se vor folosi pipete cu dopuri de bumbac. Nu se vor amesteca lichidele prin pipetarea rapida sus si jos, nu se va folosi forta excesiva pentru a elimina materialul din pipeta si nu se vor introduce bule de aer prin lichid cu ajutorul pipetelor. Se va evita eliberarea continutului unei pipete de la inaltime intr-un recipient. Se va elimina lichidul cat mai aproape posibil de nivelul lichidului recipientului de primire, sau se va permite lichidului sa coboare pe marginea recipientului. Folosirea corespunzatoare a echipamentului poate minimiza de asemenea riscul aerosolilor. De exemplu, cand se foloseste o centrifuga trebuie sa ne asiguram ca recipientele de centrifugat sunt inchise adecvat si sa se evite picaturile de lichid de langa gura recipientului de centrifugat.

Hota cu flux laminar

Hota cu flux laminar trebuie sa fie localizata intr-o arie a laboratorului in care exista o perturbare minima a curentilor de aer. Trebuie sa se evite a plasa hota cu flux laminar langa intrare, curenti de aer, sau zone unde se desfasoara o activitate intensa. Hotele sunt adesea plasate in incaperi dedicate lor. Ele trebuie mentinute curate si trebuie sa se evite depozitarea echipamentului in interiorul lor. Inainte de a incepe lucrul in hota, se dezinfecteaza suprafata hotei ca si orice sticla ce urmeaza a fi introdusa si apoi plasat tot ce este necesar procedeului de cultivare in hota. Se aranjeaza echipamentul, pipetele, recipientele de reziduuri si sticlele de reactivi astfel incat produsele folosite sa nu fie plasate langa cele curate si sa se evite trecerea produselor folosite peste produsele curate.

Contaminarea culturilor celulare

Prezenta microorganismelor poate inhiba cresterea celulara, ucide celulele si conduce la rezultate inconsecvente. Caile potentiale de contaminare sunt numeroase. De exemplu, culturile pot fi infectate prin manipularea necorespunzatoare, de la mediile, reactivii si echipamentul (de exemplu, pipete) contaminate si de la microorganismele prezente in incubatoare, frigidere si hote cu flux laminar, ca si de pe pielea manipulatorului si din culturi ce provin din alte laboratoare. Bacteriile, drojdiile, fungii, micoplasma si alte culturi celulare sunt contaminanti comuni in culturile de celule animale. O practica buna de laborator va preveni contaminarea culturilor celulare cu alte celule animale si culturi microbiene. O masura de precautie impotriva pierderii accidentale a culturii celulare prin contaminare este congelarea de celule pentru a restabili cultura daca este nevoie.

Contaminarea microbiana

Trasaturile caracteristice ale contaminarii microbiene sunt prezentate in tabelul de mai jos. Prezenta unui agent infectios poate fi detectata uneori prin turbiditate si o schimbare brusca de pH (de obicei indicata printr-o schimbare de culoare a mediului) si/sau moartea celulara. Totusi, in cazul anumitor infectii, nu se observa turbiditate si nici efecte adverse asupra celulelor .

Infectiile cu micoplasma

Infectiile cu micoplasma reprezinta una dintre cele mai comune si dificil de detectat infectii.

Detectarea infectiilor cu micoplasma

Micoplasmele sunt procariote mici ce cresc incet, lipsite de peretele celular si care infecteaza in mod comun culturile celulare. Ele sunt in general neafectate de antibioticele folosite in mod obisnuit impotriva bacteriilor si fungilor. Mai mult, deoarece micoplasma nu suprapopuleaza culturile celulare si nu determina in mod tipic turbiditate ele pot ramane nedetectate pentru perioade lungi de timp si pot cu usurinta sa se extinda si in alte culturi celulare. Efectele negative ale contaminarii cu micoplasma includ inhibarea metabolismului si cresterii, ca si interferenta cu sinteza acizilor nucleici si antigenicitatea celulara. Infectia acuta determina deteriorarea totala a culturii celulare, uneori cu cateva colonii aparent rezistente care pot, de fapt, sa fie cronic infectate. Infectia cu micoplasma poate fi pusa in evidenta prin colorare cu Hoechst 33258 sau prin PCR.

Eradicarea infectiilor cu micoplasma

In situatia in care o cultura prezinta infectia cu micoplasma, se indeparteaza prin autoclavare sau incinerare. Numai daca cultura celulara este absolut de neinlocuit trebuie incercata eradicarea infectiei. Acest proces ar trebui realizat de personal experimentat intr-o hota izolata care nu este folosita pentru cultivarea celulelor, de preferat intr-o camera separata. Eliminarea micoplasmei este in mod obisnuit realizata prin tratament cu diferite antibiotice disponibile comercial ca de exemplu Mynox® Mycoplasma Elimination Reagent (Minerva Biolabs), un derivat quinolona (Mycoplasma Removal Agent), enrofloxacin (Baytril®), si o combinare a tiamulinului cu minociclina (BM-Cyclin).

Contaminarea incrucisata a liniilor celulare

Contaminarea incrucisata a unei culturi celulare cu celule cu o rata de crestere crescuta (ca de exemplu, linia celulara HeLa) prezinta un risc serios. Pentru a evita contaminarea incrucisata se vor folosi numai celule dintr-o banca celulara reputabila; se va lucra numai cu o linie celulara la un moment dat in hota; se vor folosi pipete, sticle de reactivi si sticle de mediu diferite pentru diferite linii celulare si se vor verifica celulele regulat pentru caracteristicile morfologice si de crestere.

Conditiile de cultivare a celulelor

Mediile si serul

Alegerea mediului de cultura celulara este extrem de importanta si afecteaza in mod semnificativ succesul experimentelor de culturi celulare. Diferite tipuri celulare au cerinte de crestere specifice si foarte variate si cel mai potrivit mediu pentru fiecare tip celular trebuie determinat experimental. Mediile bazale comune includ Eagle Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640, si Ham F10. Acestea contin un amestec de aminoacizi, glucoza, saruri, vitamine si alte substante nutritive si sunt disponibile fie ca pudra fie ca lichid de la diferiti furnizori comerciali. Mediile bazale sunt de obicei suplimentate chiar inainte de folosire cu ser, L-glutamina si antibiotice si/sau fungicide pentru a da un mediu complet denumit si mediu de crestere.

Serul este un material partial nedefinit care contine factori de crestere si fixare si poate prezenta o considerabila variatie in capacitatea de a sustine cresterea celulelor. Cel mai des folosit este serul fetal bovin (FBS) dar pentru anumite aplicatii pot fi folosite seruri mai putin scumpe ca de exemplu de cal sau de vitel. Diferite loturi de ser trebuie testate pentru a gasi cel mai bun ser pentru fiecare tip celular.

L-glutamina este un aminoacid instabil care cu timpul este convertit la o forma care nu poate fi folosita de celule si ar trebui adaugata la mediu chiar inainte de folosire. Antibioticele si fungicidele trebuie folosite pentru a preveni contaminarea microbiana. Concentratia de lucru a antibioticelor si fungicidelor folosite in mod comun este prezentata in Tabelul 11.

Anumite tipuri celulare, in particular celulele primare, necesita suplimente aditionale pentru a se fixa de recipientul de cultura si prolifera, ca de exemplu colagen si fibronectina, hormoni de tipul estrogenilor si factorilor de crestere ca factorul de crestere epidermal si factorul de crestere neural. Mediile, serul si suplimentele ar trebui testate pentru sterilitate inainte de folosire prin incubarea unei cantitati mici la 37⁰C pentru 48 ore. Daca dupa aceasta incubare se produce cresterea microbiana, mediul sau suplimentul ar trebui inlaturate.

Conditiile de incubare

Conditiile de incubare folosite pentru a creste celule in cultura sunt de asemenea importante. Culturile celulare ar trebui incubate intr-un incubator cu o temperatura si o concentratie de CO₂ strict reglate.

Majoritatea liniilor celulare cresc la 37°C si in atmosfera umeda de 5% CO2 dar anumite tipuri celulare necesita incubare la temperaturi mai mici si/sau concentratii de CO₂ mai mici.

Recipientele de cultura celulara

Alegerea recipientului de cultura poate influenta cresterea celulelor aderente. Placi Petri si flacoane care au fost tratate pentru a permite fixarea celulelor animale la suprafata de crestere sunt disponibile comercial.  

Bancile de celule

Pentru anumite culturi celulare, in special acelea care sunt valoroase exista o practica de a mentine doua stocuri de celule congelate: o banca master de celule si o banca de celule de lucru. Banca de celule de lucru cuprinde celulele din una din probele din banca de celule master, care au fost crescute pentru cateva pasaje inainte de depozitare. Cand sunt necesare celule, ele vor fi luate din banca celulara de lucru. Banca de celule master este folosita numai cand este absolut necesar. Aceasta permite ca un stoc de celule cu un pasaj cu numar mic sa fie mentinut si sa evite variatii genetice in cadrul culturii.

Instabilitatea culturii

Proiect: Fiziologia analizatorului vizual Proiect: Ereditatea - perechi identice, mostenirea unui singur factor, factorul X, gene imperfecte, incrucisarea genetica, penetranta, poligene

Rata de crestere a celulelor care au fost sub-cultivate repetat poate uneori sa scada in mod neasteptat si citotoxicitatea, de exemplu a procesului de transfectie poate fi crescuta in mod neasteptat. Aceasta instabilitate poate rezulta din variatii in conditiile de cultura, variatia genomica, si cresterea selectiva a constituentilor populatiei celulare. Se recomanda folosirea celulelor la un pasaj cu numar mic (pana la 50). Masurile de prevedere impotriva instabilitatii in linii celulare continue evita senescenta sau transformarea in linii celulare finite si mentine consistenta in experimentele de transfectie. Se recomanda crearea de banci celulare prin congelarea unor volume mici de celule pentru a le repune in cultura cand este necesar.

Consideratii generale pentru cultura primara de celule

Culturile celulare primare sunt derivate fie prin dezvoltarea celulelor ce migreaza dintr-o piesa mica de tesut (tehnica explantului primar), fie prin dezintegrarea enzimatica sau mecanica a tesutului. Cultura celulara primara este in general mult mai solicitanta decat cultura de linii celulare stabilizate.

Dupa cum am prezentat anterior, orice experiment cu tesutul uman sau animal trebuie sa fie conform cu cerintele medicalo-etice si cu legislatia utilizarii animalelor in experimente. Poate fi necesar a se solicita aprobare de la autoritatile avizate.

Riscuri

Materialul uman si de primate si probele de la biopsie si autopsie trebuie manipulate in alte hote cu clasa a II de risc. Toate mediile si aparatele trebuie dezinfectate dupa folosire prin autoclavare si imersie intr-un dezinfectant adecvat.

Materialul pentru initierea culturii

Calitatea si prospetimea materialului de start sunt importante pentru succesul culturii primare. Tesutul embrionar este mai usor de dezagregat, conduce la mai multe celule si prolifereaza mai rapid in cultura primara decat in tesutul adult. Morfologia tesutului ar trebui sa fie examinata cu grija si documentata.

Alegerea tehnicii

Dezintegrarea mecanica si proteolitica a tesutului conduce de obicei la un numar mare de celule care sunt mai reprezentative pentru intregul tesut intr-un timp mai scurt decat tehnica explantului primar. Totusi, este important a minimiza expunerea celulelor la enzime proteolitice pentru a asigura viabilitatea celulara.  

Tehnica aseptica

Conditiile de sterilitate ar trebui folosite cat mai curand posibil in procedeul de izolare. In afara laboratorului, locul de disectie ar trebui sterilizat cu un dezinfectant adecvat pentru a minimiza contaminarea si tot instrumentarul de disectie trebuie sa fie steril. Lucrand repede, tesutul ar trebui indepartat aseptic, depozitat in mediu si transportat in laborator cat mai curand posibil. In laborator, tesutul trebuie maruntit fin cu deteriorare minima. Orice tesut gras sau necrotic trebuie indepartat.

Conditii de crestere

Celulele primare au cerinte de crestere mult diferite si specifice. In timp ce anumite celule primare necesita cu greu orice supliment de mediu pentru a ajuta fixarea si proliferarea celulara, altele se vor fixa si vor prolifera numai cand li se furnizeaza un cocktail cu suplimente specifice de mediu. Suplimentele de mediu comune includ factorii de fixare de tipul fibronectinei si colagenului, hormoni de tipul estrogenilor si factorilor de crestere ca factorul de crestere epidermal si factorul de crestere neural. Alegerea recipientului de crestere poate fi de asemenea importanta.

Protocoale esentiale pentru cultura de celule

Stabilizarea si mentinerea culturilor de celule animale necesita standardizarea prepararii mediilor, hranirii si propagarii (sau sub-cultivarii) celulelor. Culturile ar trebui examinate regulat pentru a le verifica pentru semnele de contaminare si a determina daca cultura necesita hranire si pasare.

Metode folosite in mod curent pentru cultura de celule

Decongelarea celulelor

1. Se incalzeste o baie de apa la 37°C, si se pre-incalzeste mediul in care celulele vor fi insamantate.

2. Se adauga mediu de crestere la un recipient de cultura adecvat. Marimea recipientului de cultura depinde de tipul celular ca si de densitatea celulara.

3. Se ia un criotub din stocul de celule congelate si se plaseaza pe baia de apa pana ce ele sunt decongelate.

IMPORTANT: Este recomandat sa se poarte ochelari de protectie si manusi cand se incalzesc criotubii care au fost depozitati in azot lichid deoarece criotubii pot exploda cand se indeparteaza din azotul lichid.

IMPORTANT: Se trece la etapa 4 cat mai curand posibil cand celulele s-au incalzit. Nu se va permite celulelor sa se incalzeasca inainte de a le transfera in mediul de crestere.

4. Se spala exteriorul criotubului cu un dezinfectant adecvat.

5. Se pipeteaza incet suspensia celulara decongelata in recipientul de cultura celulara ce contine mediu de crestere preincalzit. Se agita recipientul incet pentru a amesteca celulele cu mediu.

Indepartarea imediata a DMSO poate fi uneori necesara, in special pentru celulele in suspensie, celulele primare si tipurile celulare sensibile. Pentru astfel de tipuri celulare, se pipeteaza suspensia celulara decongelata in tuburi de centrifuga sterile ce contin mediu preincalzit, se centrifugheaza la 200 x g pentru 10 min, se aspira supernatantul, se resuspenda celulele in mediu de crestere si apoi se transfera intr-un recipient de cultura de celule adecvat.

IMPORTANT: Se amesteca celulele in recipientul de cultura pentru a asigura distributia uniforma a celulelor in recipient.

6. Se incubeaza celulele peste noapte in conditiile de crestere obisnuite lor.

7. In ziua urmatoare se indeparteaza mediul de crestere.

Tripsinizarea celulelor

Tripsinizarea este o tehnica care foloseste enzima proteolitica tripsina pentru a desprinde celulele de pe suprafata recipientului de cultura. Acest procedeu este realizat ori de cate ori celulele necesita sa fie recoltate (de exemplu, pentru pasarea, numararea sau colectarea celulelor pentru izolarea de biomolecule ca de exemplu ADN sau ARN).

1. Se aspira mediul si se inlatura.

2. Se spala celulele cu PBS sau HBSS, se aspira si se inlatura. Volumul de PBS sau HBSS ar trebui sa fie aproximativ acelasi cu volumul de mediu folosit pentru cultivarea celulelor.

3. Se repeta etapa 2.

4. Se adauga suficienta solutie de 1x tripsina-EDTA pentru a acoperi monostratul, se roteste recipientul de 4-5 ori.

5. Se plaseaza recipientul intr-un incubator cu CO₂ la 37°C pentru 2-3 min.

6. Se indeparteaza recipientul din incubator si se bate ferm cu palma mainii pentru a ajuta desprinderea. Daca celulele nu s-au desprins, se repune recipientul in incubator pentru cateva minute in plus.

IMPORTANT: Nu se lasa celulele in solutie 1x trypsin-EDTA pentru perioade extinse de timp. Nu se forteaza celulele sa se desprinda inainte ca ele sa fie gata sa o faca. In caz contrar se va produce gruparea celulelor. Culturile puternic confluente, celulele senescente si anumite linii celulare sunt dificil de tripsinizat. Crescand timpul de expunere la tripsina pentru a ajuta desprinderea celulelor rezistente, anumite tipuri celulare pot suferi moartea celulara deoarece sunt foarte sensibile la tripsina. In plus, anumite tipuri celulare pot rezista acestui tratament si vor produce aglomerari celulare. Aceste aglomerari celulare pot fi desprinse prin pipetarea repetata a celulelor in sus si jos cu o seringa cu ac atasat (sau pipeta Pasteur). Aceasta ar trebui sa se realizeze cat mai usor cu putinta pentru a evita distrugerea celulelor.

7. Odata desprinse, celulele se resuspenda in mediul de crestere ce contine ser. Se foloseste mediu ce contine acelasi procent de ser ca cel folosit pentru cresterea celulelor. Serul inactiveaza activitatea tripsinei.

8. Se pipeteaza incet celulele in sus si jos pentru a desprinde celulele din aglomerarile celulare. Daca se pipeteaza prea viguros, celulele vor fi distruse. Trebuie sa ne asiguram ca pipetarea nu creaza spuma. 

9. Se continua dupa cum este necesar (de exemplu, cu pasarea celulelor, izolarea acizilor nucleici, etc.).

Propagarea celulelor in cultura

Multe celule aderente vor inceta sa prolifereze odata ce ele devin confluente (de exemplu, cand ele acopera complet suprafata recipientului de cultura), si cateva vor muri daca sunt lasate intr-o stare confluenta un timp prea indelungat. Deci celulele aderente necesita sa fie pasate periodic, adica, odata ce celulele sunt confluente, o fractie din celule necesita a fi transferata intr-un nou recipient de cultura. Celulele in suspensie vor epuiza mediul lor de cultura foarte repede odata ce densitatea celulara devine prea mare, astfel ca si aceste celule necesita pasarea regulata.

IMPORTANT: Desi pasajul regulat este necesar a mentine culturile de celule animale, procedeul este relativ stresant pentru celulele aderente deoarece ele trebuie tripsinizate. Nu este recomandat a pasa celulele de mai multe ori decat o data la 48 ore.

1. Se recolteaza celulele, fie prin tripsinizare (culture de celule aderente) fie prin centrifugare la 200 x g pentru 10 min (culturi de celule in suspensie). Se resuspenda celulele intr-un volum adecvat de mediu de crestere preincalzit ce contine ser. Volumul de mediu folosit pentru a resuspenda celulele depinde de raportul de divizare (split ratio) si dimensiunea recipientului de cultura. Daca volumul folosit este prea mic, poate fi dificil de pipetat cu acuratete volumul dorit intr-un recipient de cultura nou. Daca volumul folosit este prea mare, recipientul de cultura ar putea fi prea plin in urma transferului celulelor.

Indepartarea tripsinei poate fi necesara uneori in urma recoltarii celulelor aderente, in special pentru tipurile celulare primare si sensibile. Se centrifugheaza celulele la 200 x g pentru 10 min, se aspira cu grija supernatantul si se resuspenda intr-un volum adecvat de mediu preincalzit ce contine ser.

2. Se transfera un volum adecvat de celule resuspendate intr-un recipient de cultura proaspat ce contine mediul de crestere preincalzit. Se roteste recipientul usor pentru a amesteca celulele cu mediul.

IMPORTANT: Se amesteca cu atentie celulele in recipientul de cultura pentru a asigura o distributie echilibrata a celulelor in recipient.

IMPORTANT: Anumite tipuri celulare nu vor supravietui daca sunt transferate prea putine celule intr-un recipient de cultura nou. Nu se recomanda un raport de divizare prea mare pentru celulele primare, tipurile celulare sensibile sau culturile senescente.

Pentru celulele aderente se recomanda adaugarea unui numar suficient de celule astfel incat cultura sa atinga confluenta in aproximativ o saptamana. Aceasta minimizeaza numarul de tripsinizari. Cand se determina cate celule sa se transfere intr-un nou recipient de cultura, ar putea fi util sa se ia in considerare cate diviziuni celulare vor fi necesare pentru a se atinge confluenta din nou. De exemplu, daca jumatate din celule sunt transferate, atunci cultura va necesita o diviziune celulara pentru a atinge din nou confluenta. Daca un sfert din aceste celule sunt transferate atunci vor fi necesare doua diviziuni celulare s.a.m.d. Daca o cultura se divide o data la 30 ore atunci va suferi aproximativ 5 diviziuni celulare intr-o saptamana. Un raport de divizare de 1:32 (1:2⁵) ar fi deci adecvat pentru ca celulele sa atinga confluenta in aproximativ 1 saptamana. In etapa 1 se resuspenda celulele in 8 ml de mediu si se transfera 0,25 ml intr-un recipient de cultura nou.

3. Se incubeaza celulele in conditiile lor obisnuite de crestere.

Numararea celulelor folosind hemocitometrul

Este adesea necesar a numara celulele, de exemplu cand se insamanteaza celulele pentru experimentele de transfectie. O metoda pentru numararea celulelor este de a folosi hemocitometrul. Un hemocitometru contine 2 camere (Figura 1). Fiecare camera este impartita in noua patrate majore (volum 0,1mm³ sau 1 x 10^-4 ml fiecare). Concentratia celulara este determinata prin determinarea numarului de celule din cadrul unei arii bine definite de adancime cunoscuta (volum).

1. Se curata suprafata hemocitometrului cu 70% etanol sau alt dezinfectant adecvat acordandu-se atentie a nu se zgaria suprafata ariei centrale. Se usuca cu hartie fina.

2. Se curata lamela, se umezesc foarte usor marginile, se acopera adancitura si zona centrala a hemocitometrului si se apasa usor. Este important ca lamela sa fie fixata adecvat pentru a obtine adacimea corecta a camerei. Aparitia inelelor lui Newton (inele luminoase si intunecate determinate de interferenta in aer intre lamela si suprafata de sticla a hemocitometrului) va confirma ca lamela este fixata adecvat.

3. Se recolteaza celulele, fie prin tripsinizare (cultura de celule aderente) sau prin centrifugare la 200 x g pentru 10 min (culturi de celule in suspensie). Se resuspenda celulele intr-un volum adecvat de mediu de crestere preincalzit. Pentru o numarare corecta sunt necesare cel putin 10⁶ celule/ml. Poate fi necesar a centrifuga celulele si resuspenda intr-un volum mai mic pentru a obtine concentratia dorita pentru numarare. Pentru celulele aderente este important a produce o suspensie de celule individualizate dupa tripsinizare. Gruparea celulelor va face numararea mai dificila si incorecta.

4. Se amesteca suspensia celulara si se transfera aproximativ 10 µl la marginea unei din laturi a lamelei pentru a umple una din camerele hemocitometrului. Se repeta pentru camera a doua. Distributia celulara ar trebui sa fie omogena in ambele camere. Suspensia celulara este antrenata sub lamela si in camera prin actiune capilara.

5. Se transfera lama sub microscop si se vede un patrat mare delimitat de 3 linii folosind obiectivul de 10x si ocularul de 10x. Se numara numarul total de celule in 4 din cele 9 patrate majore. Se numara celulele care acopera marginile de sus si din stanga patratelor dar nu cele care acopera marginile de jos si din dreapta (Figura 1). Aceasta impiedica numararea celulelor de doua ori. Daca densitatea celulara este prea mare, suspensia celulara ar trebui diluata, luand in considerare factorul de dilutie.

Figure 1. O camera a hemocitometrului sub obiectivul de 10x si ocularul de 10x ocular. Camera este impartita in 9 patrate majore. Imagine detaliata a unuia din cele 9 patrate majore. O:celule care ar trebui numarate; Ø:celule care trebuie ignorate.

6. Se repeta numararea pentru cea de-a doua camera pentru a da un numar total de 8 patrate.

7. Se aduna numarul de celule din cele 8 patrate si se imparte la 8 pentru a da numarul de celule in 10^-4 ml. Rezultatul se multiplica cu 10 000 pentru a da numarul de celule/ml. Daca suspensia celulara initiala a fost diluata pentru numarare se multiplica cu factorul de dilutie pentru a obtine numarul de celule/ml.

8. Se curata hemocitometrul si lamela prin clatire cu etanol 70% si apoi cu apa distilata. Se usuca cu hartie de lupa.

Determinarea viabilitatii

Colorarea cu Trypan blue reprezinta o metoda pentru a distinge celulele viabile (de exemplu, capabile de crestere) de celulele neviabile intr-o cultura. Aceasta metoda de colorare este bazata pe "excluderea colorantului": celulele cu membranele intacte exclud colorantul si sunt considerate viabile.

1. Se recolteaza celulele, fie prin tripsinizare (culturi de celule aderente) sau prin centrifugare la 200 x g pentru 10 min (culturi de celule in suspensie). Se resuspenda celulele intr-un volum adecvat de mediu de crestere preincalzit pentru a da o densitate celulara de cel putin 10⁶ celule/ml.

2. Se adauga 0.5 ml 0,4% (w/v) Trypan blue si 0,5 ml de suspensie celulara, se amesteca si se lasa 1-2 min. Cel putin 10⁶ celule/ml sunt necesare pentru o numarare exacta.

3. Se numara celulele colorate si necolorate folosind hemocitometrul. Celulele colorate in albastru nu sunt viabile iar cele necolorate sunt viabile.

Numarul de celule viabile/numarul total de celule x 100 =viabilitate (%).

Congelarea celulelor

1. Se verifica celulele sa fie sanatoase, ne-contaminate si sa prezinte caracteristicile morfologice corecte.

2. Se schimba mediul cu 24 ore inainte de congelare. Culturile celulare aderente sau in suspensie trebuie sa nu fie la densitate celulara mare pentru congelare. Se recomanda congelarea celulelor cand ele sunt in faza logaritmica de crestere.

3. Culturile aderente: se recolteaza celulele prin tripsinizare, se resuspenda in mediu ce contine ser, se centrifugheaza la 200 x g pentru 5 min, si apoi se resuspenda in mediul de congelare la o densitate de 3-5 x 10⁶ celule/ml.

Culturile in suspensie: se centrifugheaza celulele la 200 x g pentru 10 min si se resuspenda in mediul de congelare la o densitate de 5-10 x 10⁶ celule/ml.

IMPORTANT: Mediul de congelare contine DMSO care este periculos si trebuie manipulat cu atentie.

4. Se transfera 1 ml de suspensie celulara in fiecare criotub pe care se scrie numele liniei celulare, data, numarul pasajului si mediul de crestere. Poate fi util a nota si densitatea celulara in criotub. Aceasta permite determinarea densitatii celulare care furnizeaza recuperarea optima dupa decongelare.

5. Se plaseaza criotubii in cutii de polistiren si se depoziteaza la -80°C peste noapte. Este important ca celulele sa fie congelate cu o rata de 1°C/min. Un dispozitiv cu o viteza de congelare controlata poate fi folosit in loc de cutia de polistiren.

6. Ziua urmatoare se transfera rapid criotubii in azot lichid inainte ca celulele sa inceapa sa se decongeleze.

Selectia transfectantilor stabili

Inainte de a incepe este important a se avea in vedere:

. Se verifica ca linia celulara folosita sa poata produce colonii din celule izolate. Anumite linii celulare pot creste numai daca celulele sunt in contact unele cu celelalte. In astfel de cazuri, mediul adaptat sau conditionat poate fi util.

. Se alege un marker selectabil adecvat.

. Se selecteaza procedeul adecvat pentru tipul celular respectiv.

. Se determina conditiile de selectie pentru tipul celular aflat in lucru astfel:

Se divide o cultura confluenta de la aproximativ 1:5 la 1:10 (in functie de densitatea celulara post-transfectie si tipul) in mediu ce contine diferite concentratii de antibiotic; se incubeaza pentru 10 zile inlocuind mediul selectiv la fiecare 4 zile (sau dupa cum este necesar) si apoi se examineaza placile pentru celulele viabile prin colorare trypan blue. Se reprezinta numarul de celule viabile fata de concentratia de antibiotic pentru a stabili o curba doza-raspuns (kill curve). Astfel se determina concentratia cea mai adecvata de antibiotic pentru a o folosi pentru selectia transfectantilor stabili. Concentratia optima de antibiotic variaza cu tipul celular.

Procedeu:

1. Folosind metoda de transfectie selectata, se co-transfecteaza celulele cu un raport molar 5:1 de plasmid ce contine gena de interes la un plasmid ce contine o gena marker selectabila.

IMPORTANT: Se realizeaza transfectii in replici in cazul ca transfectiile esueaza sau culturile devin contaminate. Se includ co-transfectii control (plasmid control plus plasmid marker selectabil). Daca coloniile sunt obtinute din celule transfectate cu plasmid control dar nu din celule transfectate cu plasmid ce contine gena de interes, aceasta indica ca ultimul poate fi toxic. Pe de alta parte, interferenta promotorului poate reduce expresia genei de interes la un nivel sub limita de detectare a studiului de expresie genica.

2. Dupa transfectie se permite celulelor sa se divida de doua ori in conditii neselective. Daca se foloseste un plasmid ce codifica un tag de selectie, se urmaresc instructiunile producatorului pentru a preselecta celulele transfectate folosind perle magnetice si se permite celulelor sa se divida de doua ori in conditii ne-selective.

3. Se insamanteaza celulele la o densitate mica in mediul selectiv. Se folosesc cel putin 5 placi din fiecare placa transfectata pentru a maximiza numarul de colonii care pot fi izolate si multiplicate. Se inlocuieste mediul selectiv la fiecare 4 zile (sau dupa cum este necesar). Dupa 10 pana la 12 zile, se inspecteaza placile pentru coloniile rezistente la antibiotice. Atat celulele aderente cat si in suspensie ar trebui insamantate la densitate scazuta pentru selectia la antibiotice. Celulele aderente ar trebui sa acopere mai putin de 50% din suprafata recipientului de cultura. Daca celulele sunt prea dense, grupuri mari de celule, mai degraba decat celule individuale se pot desprinde din recipientul de cultura. Aceasta poate reduce eficienta procesului de selectie. Celulele in suspensie pot fi selectate in agar moale sau in placi de 96 de godeuri pentru clonarea celulelor singulare. Este important a sublinia ca densitatile mari ale celulelor in suspensie necesita schimbari de mediu frecvente deoarece pot epuiza factorii de crestere solubili importanti, prin aceasta reducand viabilitatea celulara si eficienta sistemului.

4. Se selecteaza si izoleaza colonii sanatoase mari (500-1000 celule). Coloniile din culturile in monostrat pot fi izolate fie prin folosirea inelelor de clonare (cilindrii), fie prin folosirea de scobitori sterile.

5. Pentru a ne asigura ca celulele sunt transfectate stabil, se recomanda continuarea procesului de selectie. O singura celula dintr-o colonie rezistenta poate fi transferata in microplaci de 96 de godeuri pentru a confirma ca ea conduce la o colonie rezistenta la antibiotice. Numai o celula ar trebui sa fie prezenta intr-un godeu dupa transfer. Daca este necesar ar trebui sa fie folosit un mediu adaptat sau conditionat cand se continua procesul de selectie. Pentru clonele in monostrat derivate din celule singulare in godeurile individuale ale placilor cu multi-godeuri, coloniile pot fi izolate prin recoltarea tuturor celulelor dintr-un godeu individual (de exemplu, subclonare).

Reactivi si solutii

1x PBS (phosphate-buffered saline)

137 mM NaCl

2.7 mM KCl

4.3 mM Na2HPO4

1.47 mM KH2PO4

pH ar trebui sa fie 7.4 fara ajustare. Se depoziteaza la temperature camerei.

1x HBSS (Hank's balanced salt solution)

5 mM KCl

0.3 mM KH2PO4

138 mM NaCl

4 mM NaHCO3

0.3 mM Na2HPO4

5.6 mM D-glucose

pH ar trebui sa fie 7.4 fara ajustare. Se depoziteaza la temperature camerei.

Solutie 1x trypsin-EDTA

0.05% (w/v) trypsin

0.53 mM EDTA

Se dizolva tripsina si EDTA intr-o solutie salina fara calciu si magneziu ca de exemplu 1x PBS sau 1x HBSS. Se depoziteaza solutia 1x tripsina-EDTA la -20°C. Portiuni mici pot fi depozitate la 2-8⁰C pentru 1-2 saptamani.

Mediul de crio-consevare

Mediu de crestere (RPMI, DMEM, etc.) ce contine 10-20% FBS si 5-20% glycerol sau DMSO. Se depoziteaza la -20°C. Majoritatea celulelor in suspensie sunt congelate in mediu de congelare ce contineo DMSO.

Trypan blue 0.4%

Se dizolva 0.4 g trypan blue in 100 ml 1x PBS sau 1x HBSS. Se depoziteaza la temperature camerei.