Biologia dezvoltarii

BIOLOGIA DEZVOLTARII

Ce este echivalenta genomica, unde a fost demonstrata experimental si cu ce tipuri de nuclei?

Echivalenta genomica defineste faptul ca toate celulele unui organism sunt identice din punct de vedere genetic provenind dintr-un acelasi zigot, avand, deci aceeasi informatie genetica cu acesta.

Acest concept a fost demonstrat experimental in anul 1997, de catre o echipa de cercetatori, condusa de Ian Wilmut, de la Institutul Roslin din Scotia. Experimentul a constat in introducerea in ovocite enucleate, prelevate de la oi cu fata neagra, de nuclei recoltati din celule ale glandelor mamare aflate in faza G₀ sau G₁ a ciclului celular, de la oi cu fata alba. Dupa folosirea a 276 de nuclei si a 13 mame purtatoare s-a nascut, dupa 147 de zile, Dolly, o oaie alba, identica cu rasa de la care provenea nucleul somatic.

In iulie 1998 au fost clonati primii soareci folosindu-se nuclei de celule somatice aflate in faza G₀ a ciclului celular, luindu-se in studiu nuclei de neuroni, de celule Sertolli si de celule din cumulusul oophorus. Rezultate au fost obtinute numai in cazul folosirii nucleilor din celulele cumulusului oophorus si anume, un procent de 8% din zigotii transferati s-au dezvoltat pana la termen, au aparut nou-nascutii, cumulinele, identici, ca linie, cu linia din care au provenit nucleii.

In decembrie 1998 a fost anuntata si clonarea umana, in Coreea de Sud, unde au fost folositi nuclei somatici proveniti din celulele foliculare ale granuloasei foliculului ovarian. Din 6 zigoti obtinuti, unul s-a dezvoltat pana in stadiul de 4 celule (blastomere), dar a fost distrus din cauza implicatiilor etice ale clonarii umane.

Enumerati anomalii asociate clonarii.

Anomaliile constatate in cursul experimentelor de clonare sunt urmatoarele:

a)     in nucleii celulari, cromozomii sufera modificari subtile, caracteristice celulelor batrane. Acest fenomen a fost observat de echipa lui Wilmut de la Institutul Scotian Roslin;

b)     majoritatea embrionilor mor la scurt timp dupa implantarea lor in uter, iar cei care supravietuiesc pana la nastere, prezinta anomalii de tipul: obezitate, tumori, malformatii cardiace. Aceste anomalii ale clonelor, nu sunt mostenite si de descendentii acestora, deci anomaliile sunt determinate epigenetic si nu genetic;

c)      embrionii rezultati din nuclei somatici nu activeaza genele-cheie embrionare in stadiul de blastocist; ei prezinta un model aberant al metilarii ADN si exprima precoce genele specifice nucleului donor.

Ce intelegeti prin reprogramare nucleara?

Reprogramarea nucleara descrie modificarile aparute in activitatea genelor, modificari induse experimental, prin introducerea unui nucleu intr-un mediu citoplasmatic nou. In cursul reprogramarii nucleare genele inactivate in timpul diferentierii celulare, sunt reactivate.

Care este diferenta dintre o celula specificata si una determinata?

Diferenta dintre o celula specificata si una determinata consta in aceea ca, prima se poate diferentia autonom intr-un mediu neutru, destinul ei putand fi influentat de celulele vecine, in timp ce celula determinata, este angajata deja pe o anumita cale de dezvoltare, ea putand sa se diferentieze autonom numai intr-o alta regiune embrionara.

Cum se mentine starea determinata pe parcursul diviziunilor celulare?

Destinul celulelor determinate depinde de existenta in citoplasma a unor proteine care joaca rol de factori de transcriptie, iar mecanismul, prin care se mentine starea determinata pe parcursul diviziunilor celulare, este cel al memoriei celulare.

In cazul memoriei citoplasmatice, aceasta este asigurata printr-un feed-back pozitiv, adica in prima celula determinata este activata (printr-un mecanism necunoscut) o gena a care codifica pentru un factor de transcriptie A, care translocat in nucleu se poate lega de:

promotorul genei a, asigurand un autoreglaj la nivel transcriptional;

promotorul genei b, pe care o blocheaza sau,

promotorul genei c, pe care o activeaza.

Dupa diviziunea celulei, in citoplasma exista destula proteina A care translocata in nucleu sa restabileasca modelul expresiei genice caracterisice celulei parentale.

Ce este transdiferentierea? Exemple. Prin ce se deosebeste de dediferentiere?

Acest proces a fost observat in tesuturile regenerate si consta in transformarea unui tip celular in alt tip celular inrudit.

Exemple:

a)     celulele retiniene in cultura au un fenotip caracteristic:

sunt cuboidale;

prezinta microvili la polul apical;

prezinta granule de pigment in citoplasma.

Daca se adauga in mediul de cultura: trialuronidaza, BSF si feniltiouree se constata ca:

are loc o aplatizare a celulelor;

se pierd microvilii;

dispare pigmentul din citoplasma.

Daca, in continuare, se adauga acid ascorbic are loc transdiferentierea celulelor in celule cristaliniene, ambele tipuri de celule provenind din ectoderm, fiind deci inrudite.

b) celulele cromafine (in medulosuprarenala) in cultura au un fenotip caracteristic si    secreta adrenalina. Daca in mediu se adauga un factor de crestere nervos, are loc transdiferentierea celulelor in neuroni simpatici, cu fenotip diferit si care secreta noradrenalina. Si in acest exemplu se observa inrudirea celor doua tipuri de celule, atat celulele cromafine, cat si neuronii simpatici provenind din crestele neurale.

Deosebirea dintre transdiferentiere si dediferentiere consta in aceea ca, in cazul transdiferentierei are loc transformarea unui tip de celule, in alt tip de celule cu aceeasi provenienta, deci inrudite, in timp ce prin dediferentiere aceasta transformare are ca rezultat obtinerea de celule neinrudite cu celulele initiale.

Care este diferenta dintre motivele zinc-finger ale factorilor transcriptionali din clasele: C2H2, receptori nucleari, GATA si LIM?

Diferentele dintre motivele zinc-finger ale factorilor transcriptionali din clasele C2H2, receptori nucleari, GATA si LIM constau in:

numarul si tipul aminoacizilor cu care este asociat Zn;

specificitatea functionala a acestor motive.

Motivele zinc-finger ale f TR din clasa C2H2 au urmatoarele caracteristici:

a)     Zn este asociat cu 2 Cys dintr-o structura antiparalela β si 2 Hys dintr-un α-helix;

b)     f TR zinc finger sunt implicati in:

legarea de ADN;

legarea de ARN;

formarea de hibrizi ADN-ARN;

dimerizarea proteinelor zinc finger.

Receptorii nucleari au in structura lor o regiune "C" sau DNA binding domain, de legare la ADN (inalt conservata), care contine 2 motive zinc finger cu urmatoarele particularitati:

Zn este asociat cu 4 Cys in fiecare motiv;

cele 2 motive recunosc secvente specifice din promotorul genelor si se pozitioneaza la nivelul fosei majore a ADN.

Factorii transcriptionali apartinand clasei GATA sunt implicati in fenomenul de potentare genica si contin 2 motive zinc finger care:

au Zn asociat cu 4 Cys;

recunosc o seccventa bogata in Gua-Ade-Tim-Ade.

Proteinele apartinand clasei LIM contin unul sau mai multe domenii LIM, fiecare domeniu fiind alcatuit din 2 motive zinc finger, unite prin 2 aminoacizi, in care Zn este asociat cu:

3 Cys si 1 Hys in primul motiv;

3 Cys si 1 Asp in al doilea motiv.

Enumerati factorii transcriptionali ce contin motive: zinc-finger, leucin-zipper, HLH si HTH.

Definiti termenul de potentare genica.

Potentarea genica defineste procesul prin care se realizeaza legarea factorilor transcriptionali de genele tinta, inainte de activarea acestora, permitand asamblarea mai rapida a unui enhancer si exprimarea sincrona a unor gene intr-o populatie celulara.

Indicati factorii transcriptonali care se leaga sub forma dimerica si monomerica de ADN?

Factorii transcriptionali care se leaga sub forma dimerica si monomerica de ADN sunt factorii transcriptionali din superclasa fTR cu domenii bazice, anume:

fTR din clasa Leucin-zipper si

fTR din clasa Helix-Loop-Helix.

Indicati factorii transcriptionali care depind de cofactori transcriptionali.

Factorii transcriptionali a caror activitate depinde de interactiunea cu cofactorii transcriptionali sunt:

receptorii nucleari, apartinand superclasei de fTR cu motive zinc finger si;

familia proteinelor cu homeodomeniu, care face parte din superclasa de fTR cu motiv HTH.

Ce factori transcriptionali contacteaza fosa majora din ADN? Dar pe cea minora?

Factorii transcriptionali care contacteaza fosa majora din ADN sunt urmatorii:

fTR din clasa Leucin-zipper;

Factorii transcriptionali care contacteaza fosa minora a ADN sunt:

receptorii nucleari;

familia proteinelor cu homeodomeniu apartinand superclasei fTR cu motiv HTH.

Daca in celule exista urmatoarele proteine: Id, MyoD, Myf5, Rb, AP1, ce fac ele, prolifereaza sau se diferentiaza? Explicati de ce.

Celulele prolifereaza. Odata cu aparitia in citoplasma mioblastelor a proteinelor miogene, MyoD si Myf5, este impiedicata diferentierea prematura a mioblastelor. In prezenta factorilor de crestere de tipul FGF, care se leaga de receptorii corespunzatori din membrana mioblastelor, se initiaza o cale de semnalizare cu urmatoarele efecte:

Proiect: Fiziologia analizatorului vizual Proiect: Ereditatea - perechi identice, mostenirea unui singur factor, factorul X, gene imperfecte, incrucisarea genetica, penetranta, poligene

activarea proteinelor Rb si AP-1 implicate in reglarea ciclului celular;

transcrierea intensa a genei id; proteina Id heterodimerizeaza cu o parte din proteinele MyoD si Myf5 din citoplasma;

activarea unei proteinkinaze C, care fosforileaza restul de proteine miogene, chiar la nivelul situsului de legare de ADN; in aceasta stare fosforilata, proteinele MyoD si Myf5 nu pot deveni functionale prin heterodimerizare.

Datorita acestor evenimente, mioblastele se pot divide dar nu se pot diferentia.

Ce factori transcriptionali sunt activati dupa fosforilare?

Factorii transcriptionali care sunt activati dupa fosforilare sunt:

fTR din clasa ETS, apartinand superclasei fTR cu motiv HTH;

fTR din clasa REL, apartinand superclasei care contacteaza fosa minora a ADN-ului;

Indicati un tip de factor transcriptional sechestrat in citoplasma in forma inactiva si precizati mecanismul de activare.

Proteina Extradenticle, de la Drosophila, face parte din clasa proteinelor cu homeodomeniu (superclasa fTR cu motiv HTH), joaca rol de cofactor transcriptional si apartine grupului de proteine PBC. Aceste proteine contin un domeniu similar HTH, numai ca bucla dintre primul si al doilea α-helix, prin care proteinele PBC interactioneaza cu proteinele cu homeodomeniu, contine 3 aminoacizi suplimentari. Mecanismul de activare este urmatorul:

in celulele care vor forma antenele la Drosophila se exprima gena homothorax (hth);

proteina homothorax (Hth) este implicata in convertirea proteinei Extradenticle dintr-o forma inactiva in forma activa;

Extradenticle activa este translocata in nucleu, unde, impreuna cu alte proteine reglatorii, initiaza transcrierea genelor necesare pentru formarea antenelor;

in absenta proteinei Hth, Extradenticle ramane inactiva in citoplasma.

Indicati categorii de factori transcriptionali care coopereaza in procesul transcriptional. Exemple de interactii.

Factorii transcriptionali apartinand Clasei ETS (Superclasa cu motiv HTH) se leaga de genele tinta impreuna cu alti fTR: AP-1, Pit 1, SRF. In regiunile promotor ale unor gene exista secvente adiacente EBS (ETS Binding Site) si secvente SRE (Serum Response Elements). Factorul transcriptional TCF (Ternary Complex Factor) nu se poate lega direct la secventa EBS. Legarea sa la ADN este conditionata de legarea fTR SRF (Serum Response Factor) la SRE, dupa care fTR TCF poate recunoaste secventa EBS.

Indicati mecanisme de remodelare a cromatinei. Ce mecanisme asigura activarea transcriptionala si care blocarea transcriptionala?

Remodelarea cromatinei se realizeaza prin 4 mecanisme:

existenta de proteine remodelatoare ale cromatinei;

implicarea matrixului nuclear;

metilarea ADN;

acetilarea histonelor.

Mecanismele in care sunt implicate proteine apartinand grupului de proteine remodelatoare Polycomb si proteinele specifice procesului de metilare a ADN, MeCP1si MeCP2, determina blocarea transcriptionala, iar mecanismul in care sunt implicate proteinele remodelatoare apartinand grupului Trithorax asigura activarea transcriptionala.

Ce intelegeti prin intiparire genomica? Cand are loc? Prin ce mecanisme se realizeaza?

Intiparirea genomica descrie procesul de blocare a genelor autosomale in functie de originea lor gametica, apare numai la mamifere si se refera la faptul ca genele poseda o memorie a originii lor spermatice sau ovocitare. Acest proces are loc in cursul diferentierei celulelor germinale.

Au fost propuse 2 modele ale mecanismului de intiparire genomica, in care metilarea ADN-ului contribuie la exprimarea monoalelica a genelor:

- modelul 1, in care metilarea modifica direct alela parentala si permite legarea

unor factori care induc o stare heterocromatica care blocheaza accesul factorilor activatori;

- modelul 2, in care metilarea nu actioneaza direct pe gena intiparita, ci pe o gena vecina, denumita imprintor. Cand gena imprintor este metilata, alela vecina este exprimata. Cand gena imprintor este demetilata, ea este transcrisa si formeaza o proteina represoare care blocheaza activitatea alelei vecine.

Care sunt mecanismele de compensare a dozajului?

Au fost descrise 3 mecanisme de compensare a dozajului:

a) Absenta compensatiei: - caracterizeaza genele care fac parte din familii multigenice raspandite in tot genomul (ARN_t la C. elegans);

- valabila pentru cromozomii sexului care sunt foarte mici si contin putine gene ( la fluturi si pasari);

b) Intensificarea activitatii genelor intr-un singur cromozom X:

- acest mecanism se realizeaza la Drosophila, iar cromozomul X de la mascul este transcris de 2 ori mai intens decat cromozomul corespunzator de la femela;

c) Reducerea activitatii genelor din cei 2 cromozomi X de la femela:

- la mamifere are loc inactivarea unui cromozom X in celulele somatice;

- la C. elegans are loc scaderea activitatii genelor din cei 2 cromozomi X.

Ce este compensazomul?

Toate proteinele Msl, necesare hiperexprimarii cromozomului X la masculul de Drosophila, formeaza un complex heteromeric, denumit compensazom, localizat la sute de situsuri de-a lungul cromozomului X.

Enumerati rolurile localizarii ARNm.

Localizarea ARNm are urmatoarele roluri:

asigurarea unui control translational local;

evitarea exprimarii gresite a unui ARN;

impiedicarea formarii heteromerilor in celule care exprima mai multe izoforme ale unei proteine;

asigurarea polaritatii unei celule sau a embrionului.

Enumerati si definiti mecanismele de localizare a ARNm.

Mecanismele de localizare a ARNm sunt urmatoarele:

a) Transportul nucleocitoplasmatic - implica exportul vectorial al transcriptilor printr-o anumita regiune a nucleului si localizarea acestora in citoplasma adiacenta (mecanism elucidat pentru ARN-ul Fushi tarazu);

b) Exportul mitocondrial, foarte frecvent la Drosophila, unde o serie de transcripti mitocondriali sunt exportati in citoplasma adiacenta, unde formeaza particole ribonucleice foarte abundente la polul posterior al nucleului (plasma polara);

c) Controlul spatial al stabilitatii ARN - mecanism simplu dar ineficient, prin care ARN localizat corespunzator este tradus, iar cel localizat necorespunzator este degradat. Exemplu: la Drosophila, ARN Oskar este distribuit in intreg ovocitul, dar este ancorat de granulele polare. Dupa fecundare, ARN-ul Oskar incorporat in celulele polare este tradus iar cel dinafara celulelor polare este degradat;

d) Ancorarea la componente localizate anterior - ARN-ul nanos, tot de la Drosophila, este ancorat la polul posterior al ovocitului numai dupa localizarea ARN-ului Oskar;

e) Transportul directionat - a fost observat in cadrul proteinelor bazice mielinice. Daca ARN-ul acestor proteine este cuplat cu un fluorocrom si introdus intr-o oligodendrocita in cultura, el formeaza initial particule fluorescente de 0,3 µm, care incep sa se deplaseze prin microtubuli, din regiunea perinucleara in prelungiri;

f) Transportul dintr-un tip celular in altul - mecanism intalnit frecvent la Drosophila, unde majoritatea ARN-urilor sunt produse in celulele nutritive si apoi, sunt transportate, prin intermediul unei retele de microtubuli, in ovocite. Acesti microtubuli au capetele "+" in celulele nutritive si capetele "-" in ovocite. ARN-urile, asociate cu proteinele purtatoare, calatoresc prin intermediul unor proteine motoare, care se deplaseaza de la "+" la "-". Reteaua de microtubuli trece de la o celula la alta prin intermediul unor canale largi denumite canale inelare.

Cum se poate regla traducerea prin intermediul proteinelor?

Reglarea prin intermediul proteinelor este un mecanism prin care se realizeaza reglarea prin intermediul regiunii 3' UTR (Untranslated Region) si a fost observata in cazul ARNm transferinic. S-a constatat ca in zona 3' UTR a ARN-ului exista o serie de elemente IRE (Iron Responsive Element), din care unul prezinta o regiune bogata in Adenina - Uracil, care functioneaza ca situs de recunoastere pentru ribonucleaze.      Atunci cand concentratia de Fe este mare, IRP (Iron Regulatory Protein) sunt inactive, ARN-ul este recunoscut de ribonucleaze si este degradat (Fig. 5, A).

In schimb, cand concentratia de Fe este scazuta, IRP sunt active, se leaga la IRE, secventele de recunoastere pentru ribonucleaze fiind astfel mascate si ARN-ul este stabilizat.

Explicati cum se poate bloca functia unui ARNm in cursul embriogenezei si experimental.

Interactia cu alte ARN-uri este un alt mecanism al reglarii prin intermediul regiunii 3' UTR (Untranslated Region) si a fost observat la C. elegans, unde ARN-urile lin 4 (lineage) blocheaza traducerea ARN-ului lin 14, in anumite momente ale dezvoltarii embrionare. Gena lin 4 formeaza ARN-uri temporale mici, precursoare, de 70 de nucleotide, care sunt bicatenare. In prezenta unor ribonucleaze, aceste ARN-uri sunt clivate pentru a forma fragmente de 21-23 nucleotide, denumite ARN-uri temporare mici (ARN _TM), care sunt monocatenare. Aceste ARN _TM hibridizeaza cu 7 regiuni complementare din regiunea 3' UTR a ARN-ului lin 14. Aceasta hibridizare blocheaza traducerea ARN-ului lin 14.

Enumerati (in ordinea activarii lor) categoriile de gene care actioneaza in cursul dezvoltarii embrionare la Drosophila.

In cursul dezvoltarii embrionare la Drosophila actioneaza 2 mari categorii de gene:

I) Gene implicate in stabilirea segmentelor embrionare:

A) Gene coordonatoare maternale:

a) stabilirea axei anterior - posterior:

- grupul anterior: bicoid (bcd), exuperantia (exu), swallow (swa), staufen (stau).

- grupul posterior: nanos (nos), vasa (vas), valois (vls), tudor (tud), oskar (osk), pumilio (pum), staufen (stau).

- grupul terminal: torso (tor), torso-like (tsl), trunk (trk).

b) stabilirea axei dorso - ventrale

B) Gene zigotice:

a) genele domeniilor nerepetitive (GAP): hunchback z (hbz), krüppel (kr), knirps (kni), tailless (tll), giant.

b) genele perechi: fushi tarazu (ftz), even-skipped (eve).

c) genele polaritatii segmentelor: engrailed (en), wingless (wg).

II) Gene necesare stabilirii identitatii segmentelor

A)    Gene selectoare homeotice:

a) grupul HOM:

- complexul 1 - Antennapedia: labial (lab), proboscipedia (pb), deformed (dfd), sex combs reduced (scr), antennapedia (antp).

- complexul 2 - Bithorax: ultrabithorax (ubx), abdominal A (abd A), Abdominal B (Abd B).

Care gene zigotice de la Drosophila sunt activate de factori transcriptionali si care folosesc alte mecanisme (ce mecanisme)?

Genele domeniilor nerepetitive si gena fushi tarazu (ftz) din grupa genelor perechi sunt activate de factori transcriptionali. In ceea ce priveste gena even-skipped (eve), din grupa genelor perechi, datorita organizarii modulare a acesteia, reglajul genic este un exemplu de control combinat, fiind necesare 7 combinatii de proteine pentru activarea ei si alte 7 combinatii de proteine pentru blocarea ei. Spre deosebire de genele domeniilor nerepetitive si de genele perechi, care codifica pentru factori de transcriptie, genele polaritatii segmentelor codifica pentru proteine cu mecanism de actiune diferit. In plus, celularizarea embrionului impune, pentru reglarea acestor gene, mecanisme de comunicare intercelulara.

Care sunt consecintele moleculare embrionare in urmatoarele situatii (indicati cum sunt afectate procesele embrionare in aceste situatii)

a.     absenta proteinei Nanos - va determina traducerea ARN Hb maternal, va exista, prin urmare, proteina Hb maternala in regiunea posterioara a embrionului, care va bloca gena kni (knirps), ceea ce va avea ca rezultat lipsa segmentului abdomenului posterior (pitic);

b.     difuzia proteinei Gürken pe fata ventrala a ovocitului, in spatiul perivitelin ventral - ar bloca exprimarea celor 3 gene: w (windbeutil), p (pipe) si n (nudel). Nu ar mai exista proteina Nudel si, in consecinta nu ar mai fi proteina Dorsal in nuclei, s-ar activa genele zerknüllt si decapentaplegic, iar embrionii ar fi dorsalizati;

c.      absenta proteinei Knirps - duce la lipsa segmentului abominal posterior (pitic);

d.     absenta proteinei Even-skipped (Eve) - determina pierderea segmentelor pare de catre larve, acestea ramanand numai cu segmentele impare;

e.     absenta proteinei Wingless (Wg) - larvele pierd regiunile anterioare ale parasegmentelor, care sunt inlocuite cu o imagine in oglinda a regiunilor posterioare ale parasegmentelor.

Dati exemple de mutatii homeotice, ce particularitate au aceste mutatii?

Mutatiile genelor homeotice nu se caracterizeaza prin lipsa sau reducerea structurilor normale, ci prin inlocuirea unei structuri cu alta. Exemple:

absenta proteinei Proboscipedia (Pb) determina transformarea unei parti a gurii (probos) in picioare;

absenta proteinei Antennapedia (Antp) determina transformarea antenelor in picioare;

absenta proteinei Ultrabithorax (Ubx) determina transformarea halterelor (organe balansiere) intr-o pereche suplimentara de aripi.

Definiti colinearitatea spatiala si temporala. Ordonati urmatoarele gene in functie de momentul exprimarii lor spatiale (de-a lungul axei antero-posterioare) si temporale: Hox c.12; Hox a.3; Hox d.1; Hox b.7; Hox a.6; Hox d.8; Hox c.5; Hox b.9; Hox c.11; Hox a.1; Hox. d.13.

Colinearitatea spatiala si temporala se refera la faptul ca genele HOX aflate la extremitatile 3' ale grupurilor se exprima mai devreme si in domenii anterioare, in timp ce genele aflate spre extremitatile 5' ale grupurilor, se exprima mai tarziu si in domenii din ce in ce mai posterioare.

Ordonarea in functie de momentul exprimarii spatiale si temporale este urmatoarea:

Hox a.1; Hox d.1; Hox a.3; Hox c.5; Hox a.6; Hox b.7; Hox d.8; Hox b.9; Hox c.11; Hox c.12; Hox. d.13.

Mentionati care din urmatoarele gene se pot exprima in regiunea gatului si care in regiunea cozii unui embrion: Hox. a.1; Hox. d.13; Hox. a.12; Hox b.2; Hox d.1; Hox a.13.

In regiunea gatului: Hox a.1; Hox d.1; Hox b.2

In regiunea cozii: Hox a.13; Hox d.13

Consideram urmatorul caz teoretic: Gena Hox c.11 se exprima in mezodermul vertebrelor sacrale. Conform caracteristicii dominantei posterioare ce vertebre vor fi afectate in cazul inactivarii acestei gene?

Enumerati genele Hox din grupul paralog 10.

Genele Hox din grupul paralog 10 sunt: Hox a.10; Hox c.10; Hox d.10.

Indicati care din urmatoarele gene sunt mai asemanatoare structural si functional: Hox. c.10; Hox c.11; Hox d.10; Hox c.12; Hox a.11

Hox c.10 si Hox d.10;

Hox a. 11 si Hox c.11

Hox c.12

Definiti inductia prin apozitie si prin intermediul unui gradient morfogenetic. Exemple

Inductia prin apozitie implica inductia intre 2 straturi adiacente: un strat este tesut inductor care elibereaza semnale inductoare, receptionate de stratul adiacent indus. In functie de semnalele primite tesutul indus este angajat pe o anumita cale de dezvoltare. Exemplu: inductia mezodermului la Amfibii.

In cazul inductiei prin intermediul unui gradient morfogenetic, sursa de molecule inductoare se gaseste la capatul unui strat embrionar. Celulele inductoare elibereaza semnale care difuzeaza in stratul respectiv si formeaza un gradient de concentratie. In functie de concentratia de morfogeni din jurul celulelor, acestea adopta un anumit destin embrionar. Exemplu: formarea membrelor la Pasari.

Cum testati daca o molecula poate induce mezoderm?

Inductia mezodermului poate fi demonstrata in cultura. Daca se preleva celule din polul A al blastulei de Amfibie (calota animala) si se plaseaza in cultura, ea va forma aici derivate ectodermale, de tipul epidermei. Daca aceeasi calota animala este cultivata in contact cu tesut din emisfera vegetala a blastulei, aceasta calota va forma derivate mezodermale de tipul notocord, muschi sau vase de sange. Daca intre calota animala si tesutul vegetativ se interpune un filtru cu pori prea mici pentru a permite contacte intercelulare, se constata ca inductia are totusi loc, ceea ce inseamna ca moleculele inductoare difuzeza prin spatiul intercelular si nu trec de la o celula la alta prin intermediul jonctiunilor.

Prin ce mecanism actioneaza proteinele eliberate din organizatorul Spemann?

Proteinele eliberate din organizatorul Spemann sunt implicate in 2 cai de semnalizare:

a)     calea BMP - ca molecule inhibitoare ale caii de semnalizare BMP (Bone Morphogenetic Protein) si actioneaza prin 2 mecanisme:

moleculele inhibitoare se leaga de liganzii BMP, blocand accesul acestora la receptorii corespunzatori; in absenta liganzilor nu se initiaza o cale de semnalizare;

molecule inhibitoare care se leaga de liganzii BMP dar si de receptori, formand un complex trimeric care nu poate initia o cale de semnalizare.

b) calea WNT - proteina Frizbee se leaga de liganzii WNT si blocheaza accesul acestora la receptorii corespunzatori

Indicati moleculele implicate in formarea celor 3 axe ale membrelor la vertebrate si precizati zonele din care sunt eliberate.

Formarea axei antero-posterioara depinde de molecula Sonic hedgehog (Shh), eliberata din zona de activitate polarizata (ZAP), localizata in marginea posterioara a mugurelui membranar, in contact cu peretele corpului.

Formarea axei dorso-ventrale depinde de proteina WNT 7a, eliberata din ectodermul dorsal.

Formarea axei proximal-distale depinde de proteina Fibroblast Growth Factor (FGF), eliberata din creasta ectodermala apicala.

Enumerati caile de semnalizare embrionara si moleculele implicate in fiecare cale cu precizarea functiei acestora.

Caile de semnalizare embrionara sunt urmatoarele:

I)       Calea de semnalizare WNT. Moleculele implicate sunt:

A) Proteoglicani (PG) - 2 modele:

a) PG implicati in sechestrarea ligandului WNT in apropierea receptorilor corespunzatori;

b) PG functioneaza ca un coreceptor, implicat in activarea receptorilor, formandu-se un complex trimeric: PG-ligand-receptor.

B) Receptorul Frizzled; nu se cunoaste modul in care semnalul WNT este transmis in citosol;

C) Proteina Dishevelled (Dsh) - prin domeniile pe care le contine este implicata in interactiile cu alte proteine;

D) Proteinele omologe Zeste White-3 (Drosophila) si Glicogen Sintetase Kinase (vertebrate), care fosforileaza β-cateninele;

E) Proteinele Armadillo (Drosophila) si β-cateninele, implicate in interactiile cu alte proteine;

F) Pangolin (Drosophila) si TCF LEF-1 (vertebrate) sunt factori de transcriptie HMG box.

II) Calea de semnalizare TGF β. Moleculele implicate sunt:

A)    Receptori TGF β:

a) de tipul 1, al caror domeniu kinazic are rol in fosforilarea proteinelor Smad;

b) de tipul 2, al caror domeniu kinazic este implicat in autofosforilarea si fosforilarea receptorilor de tipul 1.

B) Proteine Smad de 3 tipuri

III) Calea de semnalizare Hedgehog. Componentele acestei cai de semnalizare sunt:

A)     Receptori Patched (Ptc), contin 2 domenii extracelulare neesare pentru legarea ligandului;

B)     Receptori Smoothned (Smo), asociati fizic cu receptorii Patched;

C)     Costal 2 (Cos 2), are rolul de a ancora un complex proteic la microtubuli;

D)     Fused (Fu), fosforileaza un factor de tranzitie;

E)      Cubitus interruptus (Drosophila), (Ci) si proteina Gli.

IV)   Calea de semnalizare Notch-Delta cuprinde 3 componente:

A)    Liganzi DSL;

B)     Receptori LNG;

C)     Efectori.

Care sunt consecintele moleculare in caile de semnalizare embrionare in cazurile de mai jos. Figurati in fiecare caz calea de semnalizare in respectiva situatie

a.     Proteina Armadillo/b-Catenin nu prezinta domeniul central ce contine cele 13 repetitii armadillo;

Fara acest domeniu proteina Armadillo/b-Catenin nu interactioneaza cu celelalte proteine si nu mai are loc transcriptia genelor tinta.

In prezenta ligandului WNT, atasat receptorului Frizzled, este fosforilata proteina Dsh. Proteina Dsh fosforilata blocheaza activitatea lui GSK 3β, care nu mai fosforileaza b-Catenin, aceasta ramane activa, este translocata in nucleu unde se asociaza cu fTR Pangolin/TCF/LEF1 si initiaza transcripitia genelor tinta. Daca nu exista domeniul central al b-Catenin, nu se mai formeaza complexul cu APC si GSK 3β, nu mai este translocata proteina b-Catenin in nucleu, fTR Pangolin/TCF/LEF1 nu are cu cine se asocia si transcriptia este blocata.

b.     Nu exista proteine Co-SMAD;

Fara proteine Co-SMAD, calea de semnalizare TGF-β nu are finalitate, si anume, transcriptia genelor tinta nu poate avea loc. In ultima etapa a acestei cai de semnalizare, proteinele R-SMAD fosforilate dimerizeaza cu proteinele Co-SMAD, dimerii sunt translocati in nucleu, unde in prezenta unor fTR (Fox) initiaza transcriptia.

c.      Nu are loc adaugarea de colesterol la capatul N-terminal al peptidei N-terminale Hedgehog;

In acest caz, peptida N-terminala nu mai poate sa realizeze semnalizari pe distanta scurta si distanta lunga.

d.     Doua celule vecine exprima: una proteina Delta cealalta LAG-2. Ce cale de semnalizare este initiata?

Nicio cale de semnalizare.

Cum se deosebesc in microscopia electronica veziculele autofagice de alte tipuri de vezicule?

In microscopia electronica, veziculele autofagice se deosebesc de alte tipuri de vezicule, prin faptul ca sunt bimembranare, adica sunt inconjurate de 2 membrane.

Enumerati si precizati principiul metodelor de detectare a apoptozei.

Moartea celulelor prin mecanisme de apoptoza poate fi pusa in evidenta prin trei metode moleculare diferite, in functie de stadiul de evolutie al procesului :

A) Colorarea cromatinei cu iodura de propidium - metoda ce arata modificarile morfologice nucleare si formarea corpilor apoptotici ca efect de fragmentare a cromatinei;

B) Tehnica TUNEL aplicata pentru identificarea proceselor de apoptoza in plina evolutie;

C) Extractia si separarea electroforetica a ADN-ului apoptotic (prin aceasta tehnica se pot evidentia si procesele de necroza suprapuse peste cele de apoptoza).

A) Colorarea cromatinei cu Iodura de propidium

Iodura de propidium este un colorant vital fluorescent pentru ADN dublu catenar. Acesta nu traverseaza sistemul celular membranar al celulei viabile si nici al celor in care apar fenomene premergatoare apoptozei. In contrast cu acest comportament, in celulele aflate in stadii tardive de apoptoza sau deja moarte, integritatea membranei este distrusa si iodura de propidium poate patrunde in celule, fiind detectabila in scala orange, cu lungimea de unda λ = 569,588 nm.

In situ, coloratia cu iodura de propidium este intotdeauna binevenita, deoarece diferentiaza foarte clar modificarile aparute in modul de organizare a cromatinei in diferite stadii de diviziune celulara, corpii apoptotici si in plus modificari de forma ale membranei nucleare: inmuguriri, plieri, etc.

Pe sectiuni histologice se dizolva lipidele membranare cu detergenti neionici, se elimina apoi citoscheletul, proteinele nucleare si moleculele RNA prin digestie enzimatica cu tripsina, respectiv RN-aza, ulterior se stabilizeaza cromatina cu spermina si se aplica iodura de propidium.

B) Studiul gradului de fragmentare a DNA prin metoda TUNEL

In vederea detectarii punctelor de fragmentare a ADN s-a utilizat o reactie de marcaj de tip exogen, catalizata de terminal-deoxi-transferaza (TdT). Reactia este numita fie reactie de marcaj terminal (end-labelling), fie, generic, TUNEL (Terminal-Uridin-Nucleotide-End-Labelling). Aceasta ultima denumire exprima capacitatea reactiei in sine, de marcare a catenelor de ADN, intr-un punct terminal (3 OH) prin aditie de nucleotide uridin-trifosfat (UTP), tot procesul fiind intermediat de catre enzima TdT. Enzima TdT catalizeaza aditia independenta a dUTP marcata in diverse moduri (Br, FITC, DIG). Molecula de marcaj este revelata cu anticorpi specifici, marcati la randul lor cu fosfataza alcalina (PA). In final, fenomenul de apoptoza este analizat in baza efectului cromogen generat de PA fata de substrat si nitro-blue-tetrazolium (NBT).

C) Extractia si separarea electroforetica a DNA apoptotic

Unul dintre fenomenele tarzii ale apoptozei este fragmentarea DNA ca rezultat al activarii endonucleazelor de restrictie in timpul "programului de apoptoza". Enodonucleaza degradeaza masiv structura cromatinei la nivel internucleosomal rezultand fragmente de ADN, cu 180-200 perechi de baze sau multiplii de (200pb)n.

Evenimentul ce apare relativ repede in moartea celulara toxica si caracterizeaza apoptoza, este aparitia pe suprafata membranara a unor protuberante, "blebs", fenomen cunoscut ca inmugurire membranara. Patofiziologia acestor modificari implica alterari ale citoscheletului, atribuite de asemenea, alterarii homeostaziei calciului intracelular. Acest lucru e demonstrat de mai multe observatii:

o perturbare a Ca2+ intracelular, cu o concentratie crescuta un timp indelungat ,se asociaza cu inmugurirea membranara determinata de diversi compusi toxici, inclusiv ionofori de calciu;

lipsa calciului din mediul de cultura sau tratarea culturilor cu chelatori de Ca2+ intracelulari intarzie sau chiar previne aparitia mugurilor membranari.

Pe baza articolului intitulat Apoptoza se va raspunde la urmatoarele intrebari:

Enumerati componentele caii apoptotice intriseci și extrinseci si precizati elementele comune celor doua cai.

Calea "receptorilor mortii" (apoptoza extrinseca) este activata atunci cand membrii superfamiliei TNF (Tumor Necrosis Factor) leaga la suprafata celulei "receptorii mortii", membri ai familiei TNF-receptor (FAS, TNF, TRAIL). Mecanismul de activare a receptorului FAS (Apoptosis stimulating fragment) joaca un rol esential in apoptoza. Semnalele emise de FAS recruteaza un complex format din proteinele adaptor FADD (FAS - Associated Death Domain) si Caspaza 8. Formarea acestui complex antreneaza scindarea Caspazei 8, trecerea in forma ei activa de dimer, antrenand astfel o cascada de activari secventiale ale diferitelor caspaze, printre care si Caspaza 3. Proteina c-FLIP (FLICE - Inhibitory Protein), in functie de concentratia ei, poate sa inhibe sau sa potenteze legarea FADD si a Caspazei 8 la FAS.

Calea mitocondriala (apoptoza intrinseca) este controlata de interactiunea dintre membrii proapoptotici si antiapoptotici ai familiei BCL2 (B - Cell Lymphoma 2). Caspaza 9 regleaza aceasta cale si intervine dupa ce senzorii intracelulari indica leziuni majore ale celulelor. Initiatorii acestei cai sunt factorii nocivi (leziuni ale ADN, raspunsul proteinelor unfolded, pierderea factorilor de crestere) care activeaza proteinele proapoptotice BH3-exclusive (Bcl-2-homology domain 3 only). Acestea interactioneaza si inhiba proteinele antiapoptotice BCL2 sau BCL-XL (B-cell lymphoma-extra large), eliberand proteinele proapoptotice BAX (Bcl-2-associated X protein) si BAK. Acestea induc permeabilitatea membranei mitocondriale si eliberarea Citocromului c, care activeaza proteina APAF-1 (Apoptosis protease activating factor-1), care la randul ei, recruteaza Caspaza 9 formand un complex proteic, numit apoptozom. Acesta activeaza Caspaza 3, care scindeaza actina citoscheletului si finalizeaza procesul de moarte celulara.   Proteina SMAC DIABLO este eliberata, de asemenea, dupa permeabilizarea membranei mitocondriale si are rolul de a bloca actiunea proteinelor IAPs (Inhibitors of Apoptosis Protein) care inhiba actiunea Caspazelor.

Elementele comune ale celor 2 cai apoptotice sunt:

- proteina proapoptotica tBID (Truncated form of BID), care face parte din grupul proteinelor BH3-exclusive. Caspaza 8 scindeaza aceasta proteina, partea COOH-terminala este translocata in mitocondria unde actioneaza ca inhibitor al proteinelor antiapoptotice BCL-XL-BCL2 si BCL2-BCL-XL, ca activator al proteinelor proapototice BAX si BAK, avand ca rezultat final eliberarea citocromului c si a proteinei APAF-1, formarea apoptozomilor prin recrutarea Caspazei 9, activarea Caspazei 3, scindarea actinei citoscheletului si distrugerea celulei;

- Caspaza 3, ambele cai apoptotice avand drept tinta activarea acesteia.

Indicati substante / compusi care induc  apoptoza,  precizati mecanismul lor de actiune si indicati care sunt beneficiile in clinica.

a) ABT - 737, o peptida mimetica BH3, actioneaza ca antagonist al membrilor familiei antiapoptotice BCL2 si BCL-XL si, de asemenea, potenteaza efectul unor medicamente anticancer;

b) ABT - 263, un analog oral al ABT - 737, induce apoptoza prin inhibarea proteinelor antiapoptotice apartinand familiei BCL2 - folosit in cazul leucemiilor, limfomul non-Hodkin, cancer de plamani, mielom multiplu;

c) Inhibitorii PARP (poly-ADP-ribose polymerase)- previn repararea lanturilor de ADN intrerupte, ceea ce conduce la apoptoza. Sunt folositi in cazul cancerelor de san, ovarian, al tumorilor-solide, glioma;

d) Topotecan (Hycantin), induce apoptoza prin inhibarea topoizomerazei I, o enzima esentiala pentru replicarea ADN-ului si se foloseste in cancerul ovarian, cancerul cervical, cancerul pulmonar;

e) XIAP (AEG35156), induce apoptoza prin distrugerea inhibitorilor endogeni ai Caspazei si se utilizeaza in cancerul de plamani, cancerul de pancreas, cancerul de san;

f) antagonist al survivin, actioneaza prin inhibarea proteinei survivin, un inhibitor endogen al Caspazei, inducand apoptoza si se foloseste in leucemia mieloida acuta.