Aspecte teoretice si practice ale culturilor de celule animale - raspunsuri

Aspecte teoretice si practice ale culturilor de celule animale

Raspunsuri

1. Comparati din punct de vedere al evolutiei capacitatii proliferative: culturile primare, culturile finite si liniile celulare continue obtinute prin imortalizarea spontana, cu virusuri AND tumorale sau hTERT.

Daca doriti sa obtineti o linie celulara continua, care sa prezinte caracteristici cat mai apropiate de cele manifestate in vivo ce metoda de imortalizare aplicati?

Culturile primare, culturile finite si liniile celulare continue difera intre ele din punct de vedere al potentialului lor proliferativ.

Culturile primare reprezinta multiplicarea celulelor ce migreaza dintr-un fragment de tesut (cultura de explant) .In culturile primare celulele adera de recipientul de cultura si se multiplica pana ce acopera intreaga sa suprafata (monostrat celular).

Culturile primare sunt capabile numai de un numar limitat de diviziuni celulare (pana cand ele ating confluenta) stare non-proliferativa (senescenta) si eventual mor. Sunt mai dificil de realizat decat culturile de linii celulare continue si uneori preferate in raport cu liniile celulare continue in sistemele experimentale datorita similaritatii mai mare din punct de vedere fiziologic cu celulele in vivo.

Culturile primare au o durata de viata limitata si scurta daca nu sufera procesul de transformare.

Culturile celulare finite (secundare) se formeaza dupa prima subcultivare (pasaj) a culturii primare. Dupa un numar limitat de diviziuni celulele ajung la senescenta.

Liniile celulare continue stabilizate deriva din culturile primare, se mentin in viata timp nelimitat prin subcultivari.

Culturile primare de soarece pot devenii linii celulare continue fie spontan, fie in urma expunerii la un agent mutagen. Culturile celulare primare umane pot deveni linii celulare continue prin manipulari genetice.

Linie celulara finita este imortala cand sufera o modificare fundamentala ireversibila sau "transformare" ce se poate produce spontan sau prin actiunea medicamentelor, radiatiilor sau virusurilor. Celulele transformate cresc mai usor si mai rapid, putand avea cromozomi suplimentari sau anormali si pot fi crescute frecvent in suspensie.

Culturile cu fenotip intermediar intre culturile finite si culturile continue au perioada mai mare de proliferare pana ajung la senescenta.

Imortalitatea celulara a liniei celulare continue e mai usor de manipulat decat culturile celulare primare sau finite.

Imortalizarea spontana reprezinta capacitatea celulelor diploide normale de a depasi senescenta in absenta unor agenti exogeni adaugati intentionat.

Culturile primare sufera senescenta la mai putin de 90 dublari populationale, extinderea duratei de viata prin expresia virusurilor ADN tumorale este de aproximativ 20 dublari populationale. O cultura imortala este capabila de mai mult de 100 dublari populationale.

Fibroblastele si celulele epiteliale umane devin imortale doar ocazional. Majoritatea celulelor murine au capacitatea de a imortaliza spontan ca rezultat al actiunii unor factori de mediu si al modificarii ADN endogen -factori ineficienti in celulele umane.

Imortalizarea cu virusuri ADN

Celulele somatice pot fi imortalizate, desi cu o frecventa scazuta, in urma infectiei cu virusuri ADN tumorale(SV40, HPV16 si 18, adenovirusul 5 si oncogena Ras).

Rezultatele sunt destul de diferite: Ras poate transforma celulele stabilizate dar nu celulele mamaliene primare in celulele primare, expresia ectopica a Ras conduce la o stare de tipul senescentei.

Pentru extinderea potentialului proliferativ s-a incercat introducerea unor gene virale transformante (gena T-large antigen din virusul simian SV40).

Antigenul mare T este oncoproteina majora a SV40, codificata de regiunea early a ADN. Aceasta intrerupe controlul cresterii celulare prin interactiile cu proteinele p53 si Rb, pe care le inactiveaza. Celulele ce exprima oncoproteineleSV40 prolifereaza pentru aproximativ 20-60 dublari populationale dincolo de punctul in care echivalentii lor normali devin senescenti.

Exista unele limitari ale imortalizarii celulelor cu virusuri ADN tumorale. S-au obtinut modificari nedorite in liniile celulare imortale, inclusiv in: stadiul de diferentiere (pierderea proprietatilor diferentiate), caracteristicile de crestere, morfologie, fiziologie, cariotip si potetialul de transformare.

Expresia fortata a hTERT inainte de senescenta poate conduce la imortalizare.

hTERT apare a fi limitanta in multe celule normale: expresia hTERT exogena este suficienta pentru a induce activitatea telomerazei

Telomeraza stabilizeaza lungimea telomerilor prin sinteza de ADN telomeric nou si extinde capacitatea celulara proliferativa.

Referat: Anatomia aparatului locomotor - sistemul osos, rolul oaselor in organism Referat: Reflexe mucoase

Daca introducerea hTERT nu are ca rezultat imortalizarea, aceasta reflecta un alt tip de oprire a cresterii care este telomer-independenta si pare a reflecta conditii de cultivare neadecvate ce conduc la STASIS (Stressor Aberrant Signaling Induced   Senescence) sau ceea ce se numeste senescenta prematura sau socul culturii.

Expresia ectopica a genei hTERT in anumite celule telomeraza-negative extinde limita de viata a acestor celule.

EX:Fibroblastele BJ din preput, hTERT imortalizate prolifereaza pentru 200 de dublari populationale suplimentare. Expresia genei hTERT permite supravietuirea celulelor transformate oncogenic dincolo de limita de criza.

Pentru a obtine o linie celulara continua care sa prezinte caracteristici cat mai apropiate de cele manifestate in vivo se foloseste metoda de imortalizare cu hTERT.

Expresia ectopica a hTERT(humanTelomerase Reverse Transcriptase) poate extinde durata de viata a celulelor normale fara a determina: transformarea celulara si instabilitate genomica..

Celulele imortalizate cu hTERT manifesta rate de crestere normale, sunt ne-tumorigenein soareci nuzi, nu prezinta crestere independenta de fixare chiar cand sunt transfectate cu E6/E7 sau oncogena ras activata, poseda un cariotip normal , necesia factori de crestere pentru proliferare, nu cresc in prezenta unei concentratii de ser de 0,01% si isi mentin inhibitia de contact.

2. Enumerati etapele interactiei celulelor cu suprafata suportului de cultura. Care este principala cale de reglare a acestei interactii si cum poate influenta comportamentul cellular?

Principalele etape ale interactiei celulelor cu suprafata suportului de cultura sunt:

1. adsorbtia proteinelor din mediul de cultura.

2. formarea legaturilor adezive celule-proteine adsorbite (fixarea si adeziunea celulara)

3. Celulele aderate de pe supragata suportului pot decide in functie de natura substratului sa sufere procese de:

- migrare, proliferare/diferentiere celulara.

- moarte celulara

- latenta celulara

- sinteza si secretie de molecule specifice

Principala cale de reglare a acestei interactii celula-suprfata suportului sau substrat se realizeaza prin activarea mediata de integrine a caii de semnalizare FAK-MAPK.

Celula in contact cu substratul prin adeziuni focale face ca integrinele sa medieze transmiterea semnalelor la nucleu prin intermediul acestei cai de semnalizare FAK/MAPK.

3. Prezentati de ce majoritatea culturilor necesita glutamina in mediul de cultura (de regula 1%) si de ce este necesar ca aceasta sa fie adaugata lunar daca mediul de cultura nu se utilizeaza complet in acest interval.

Glutamina

Este necesara majoritatii culturilor celulare (insa anutmite linii utilizeaza Glu) avand urmatoarele caracteristici:

• Sursa majora de Carbon - furnizeaza precursori pentru biosinteza proteica.
• Sursa de energie prin:

generarea de glutamat de catre glutaminoza

Glutamina + H2O → Glutamat + NH3

intrarea in ciclul Krebs prin transformarea Glu la 2-OG

Glutamat + NAD →2-OG + NH3 + NADH, H

Glu + OxAc → 2-OG + Asp

Glutamina trebuie adaugata lunar in mediu de cultura, chiar daca acesta nu a fost utilizat in acest interval datorita faptului ca aceasta dupa o perioada mai lunga in mediu poate suferii o dezaminare adica eliberarea de amoniac in mediu, iar amoniacul este toxic pentru celule si poate limita si cresterea celulara.

Glutamina mai poate determina o ciclizare spontana la pirolidona in mediul de cultura ce duce la o viabilitate si productivitate celulara limitata.

4. Caracteristici ale celulelor senescente. Cunoasteti situatii experimentale in care celulele senescente in cultura pot dobandi morfologia celulelor tinere? Exemplificati.

Senescenta - este un fenomen universal si implica modificari la nivelul functiei si morfologiei celulei.

Senescenta apare la celulele normale de origine umana sau soarece, de natura fibroblastica, epiteliala, etc, dupa ce a avut loc o propagare in cultura sau ca raspuns la conditii de crestere neadecvata sau stres fiziologic.

- nu apare in liniile celulare transformate.

Caracteristici ale celulelor senescente:

- incapacitatea de a raspunde la stimuli mitogeni

- modificari dramatice in structura cromatinei si expresia genica.

- celulele devin mai mari, mai aplatizate si vacuolizate

- manifesta adeziune crescuta la matricea extracelulara (ECM( in timp ce pierd contactele celula-celula.

- raman in stare de celule viabile, dar incapabile de diviziune pentru cateva luni.

- acumuleaza granule de lipofuscin ( o substanta intralizozomala nedegradabila) care se formeaza datorita:

peroxidarii acizilor grasi nesaturati

contine lipide, glucide si metale: Hg, Fe, Al, Cu, Zn

emite fluorescenta in domeniul 345-550 nm.

- manifesta modificari specifice tipului celular cum ar fi: fibroblastele senescente dezvolta un fenotip constitutiv de degradare matriceala, secretand cantitati mari de metaloproteinaza matriceale (MMP): colagenaza interstitiala MMP-1 si stromelizina MMP-3.

- secreta citokine inflamatorii de tip iL1 si factori de crestere

- exprima β-galactozidaza asociata senescentei (SA- β-GAL), ce are un pH optim de 6.

Exemplu de celule senescente care pot dobandii morfologia celulelor tinere sunt celule maligne(prezinta caracteristici identice cu celulele tinere), astfel ca celulele senescente prin transformare maligna pot devenii celule tinere.