Markerii utilizati pentru identificarea celulelor stem embrionare murine

Markerii utilizati pentru identificarea celulelor stem embrionare murine

Celulele stem embrionare de soareci sunt usor de recunoscut dupa morfologie avand disproportionalitate nucleu-citoplasma si nucleoli proemineti, dar pentru identificarea sigura cercetatorii utilizeaza markeri celulari (fig.7, tabel1) (Stem Cells Basics 2005, Robert L., 2006).

Acesti markeri sunt reprezentati de receptorii de natura proteica de la nivelul invelisului celular cu capacitate de a lega selectiv sau de a adera la alte molecule semnalizatoare. In mod normal celulele folosesc acesti receptori si moleculele fixate pentru comunicare si buna desfasurare a functiilor organismului.

Fig.nr.7 - Modul de atasare al markerilor la nivelul membranei celulei stem

(Winslow, Terese, 2001).

Activitatea de identificare este avantajata de faptul ca fiecare tip celular prezinta o anumita combinatie de receptori de suprafata, ceea ce o face usor de recunoscut printre alte celule. Markerii celulelor stem sunt numiti in functie de moleculele care se leaga pe receptorii de suprafata. De exemplu, o celula care are receptori stem antigen-1 pe suprafata este identificata ca fiind Sca-1 (Shamblott, M.J. et al., 2001, Wobus A., 2005).

Se pot utiliza si combinatii de markeri pentru identificarea unui tip particular de celule stem, de exemplu, un tip special de celule stem hematopoetice din sange si maduva osoasa hematopoetica, numite "side population" sau "SP" este descris ca fiind CD₃₄-, C-kit, Sca-1 (Kania G., 2003).

Acum cativa ani a fost dezvoltata tehnica de atasare la molecula de semnalizare a unei alte molecule care are abilitatea de a deveni fluorescenta sau de a emite aceasta fluorescenta prin intermediul unei surse de energie.

In prezent cercetatorii utilizeaza pentru identificarea populatiilor specifice stem, o combinatie de proprietati chimice ale fluorescentei cu un model unic de receptori de suprafata. Tehnica poarta numele de florescence-activated cell sorting (FACS).

Alta metoda foloseste markeri celulari stem si fluorescenta dezvoltata pentru a aprecia prezenta acestora in tesuturi. In acest fel, se poate aprecia modalitatea de aparitie a celulelor stem in tesuturi pe baza fluorescentei pe care o emit, fapt usor de vizualizat la microscopul cu fluorescenta (Shamblott, M.J. et al., 200, Robert L., 2006).

Identificarea celulelor stem se bazeaza si pe depistarea prezentei unor gene prin intermediul tehnicii PCR (polymerase chain reaction). Aceasta tehnica a stat la baza identificarii markerilor genetici caracteristici celulelor stem.

Tabel nr. 1 - Markeri celulari utilizati in identificarea celulelor stem

www.scienceiionline.com)

Ingineria genetica utilizeaza fluorescenta neconditionata a markerilor de suprafata. Importanta acestei noi tehnici consta in urmarirea modului in care celulele stem se diferentiaza si devin celule specializate. Pentru aceasta cercetatorii au inglobat in celulele stem un "reporter gene" numita proteina fluorescenta verde sau GFP. Aceasta gena este activata doar atunci cand celula devine specializata (Lichner Zs., 2008). Odata activata, gena directioneaza celulele stem pentru a produce o proteina care emite o fluorescenta verde, stralucitoare (Shamblott, M.J.,2001)

Nu trebuie omis faptul ca factorul capabil de a stimula autotreinnoirea si de a inhiba diferentierea, este asigurat de celulele feeder. LIF - leukemia inhibitory factor - membru al familiei cytokinelor IL-6 (Brock J.C. si col. 2004). Aceasta descoperire a permis cultivarea celulelor stem embrionare libere de celule feeder pe placi de cultura gelatinizata in prezenta mediului de crestere completata cu ser si cu un factor inhibitor leucemic (LIF) recombinat.

In timp ce celulele masei celulare interne au o existenta efemera in embrion, celulele stem embrionare pot fi propagate extensiv in vitro. In mod surprinzator in timp ce celulele stem embrionare crescute in cultura depind de factorul inhibitor leucemic, embrionii deficitari de acest factor prezinta o dezvoltare normala.

Rolul fiziologic al factorului inhibitor leucemic in embrionul de soarece pare sa fie acela de a mentine viabilitatea masei celulare interne in timpul diapauzei, o perioada in care dezvoltarea embrionului este oprita. Astfel rolul factorului leucemic poate fi acela de a mentine populatia de celule stem pluripotente in afara timpului normal de dezvoltare. Receptorul acestui factor este format din subunitatea receptiva β a factorului inhibitor leucemic (LIFRβ) si din transductorul de semnale paracrine gp130. Efectul factorului inhibitor leucemic, asupra reinnoirii nu este exclusiv dar afecteaza de asemenea si un grup unic de citokine care actioneaza pe calea receptorului gp130. Angajarea factorului inhibitor leucemic de catre receptorul sau mediaza activarea a doua cai majore intracelulare, calea JAK-sat si calea SHP2-Erk. Ulterior legarii factorului de receptorul sau, acest complex, in asociatie cu fosfataza JAK activeaza tirozin kinaza care va fosforila lanturile receptoare.

Un factor transcriptional latent STAT3, care contine un domeniu omolog 2 (SH2) este fosforilat de fosfataza JAK care realizeaza la randul sau dimerizarea factorului activator de transcriptie STAT3 si apoi translocarea in nucleu, unde se leaga pe situsurile ADN, controland astfel transcriptia genelor importante in reinnoirea celulelor stem embrionare (Robert L., 2006).          

Un marker clasic al celulelor stem embrionare nediferentiate este expresia factorul de transcriptie POU gena Oct4 cunoscut ca si Oct 3 sau Oct ¾ (Fig. 8 si 9)

Exprimarea sa este evidenta la celulele stem totipotente si pluripotente, obtinute de la embrionii de soarece si este slab exprimat la tesuturile adulte, excluzand linia germinala.

Fig. nr.8- Expresia Oct4 in stadiu de morula si blastocist

(Robert L. si col., 2004 - Handbook of stem cells)

Fig. nr.9 - Celule Oct 3/4, SSEA4 si PA pozitive

(Robert L. si col., 2004 - Handbook of stem cells)

Markerul celular Oct4 este un factor cheie care regleaza reinniorea celulelor stem embrionare. Nicholas si colaboratorii au aratat faptul ca rolul factorului de transcriptie Oct4 in vivo, este acela de a stabilii natura pluripotenta a celulelor in masa celulara interna. Nivelul de exprimare al factorului de transcriptie in celulele stem embrionare, este esential pentru mentinerea reinnoirii acestora.

O crestere mai mica de doua ori determina celulele stem embrionare sa se diferentieze in mezoderm sau endoderm in timp ce reducerea cu 50% a nivelelor cauzeaza diferentierea in trofectoderm (Lisa Fortier, 2005). Deoarece markerul celular Oct4 nu este o gena tinta a semnalului de transducere si activator de transcriptie STAT3 exprimarea sa nu este legata direct de factorul inhibitor leucemic (LIF).

Atunci cand gena Oct4 este exprimata in celulele stem embrionare ea nu previne diferentierea indusa de retragerea LIF, de accea exprimarea Oct4 nu este suficienta pentru a mentine pluripotenta, fiind necesara actiunea de inducere a citochinei de catre STAT3.

Se cunoaste faptul ca gena Oct4 actioneaza in interiorul celulelor stem embrionare in mai multe moduri. Multe gene exprimate de celulele stem embrionare (ex: proteina zinc Zfp42/Rex-1) au markerul celular Oct4 in elementele lor regulatoare putand astfel acesta poate activa direct aceste gene tinte. Oct4 poate de asemenea sa activeze sau sa reprime alte gene tinta cooperand cu anumiti co-factori transcriptionali. Doi dintre acesti factori sunt reprezentati de Sry related factor Sox2 si FoxD3, care functioneaza in cooperare cu factorul de transcriptie celular Oct4 (Robert L., si col 2004).