Culturi de celule - inginerie tisulara

CULTURI DE CELULE - INGINERIE TISULARA

Definitie

Cultura de celule - metoda de crestere a celulelor animale si umane in conditii artificiale, in afara actiuniilor sistemice ale organismului.

Istoric

1907 - Harrison: 1912 - Carrel (primii care au folosit metoda pentru studiul comportamentului celulelor animale in afara variatiilor sistemice si a stresului)

Metoda la inceput - migrarea celulelor din fragmente de tesut nedezagregat (metoda folosita inca timp de 50 ani)

Alte evenimente importante

1916 - metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice

1940 - introducerea antibioticileor in tehnica de lucru

1952 - transplant de nucleu

1955 - medii artificiale complexe

1964 - celule stem de soarece (pluripotente)

1966 - primul factor de crestere (NGF)

1970 - aparitia primelor hote cu flux laminar

1976 - medii sintetice, fara ser sanguin bovin

1980 - dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara

1998 - cultura de celule umane stem

2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro
(in cultura celulara)

Controlul mediului extracelular

pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera

Componente nutritive

Micromediu (celule-celule, celule-MEC)

Omogenitatea materialului

Medii selective , clonare

Economie, scara redusa, mecanizare

Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice

Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost  avantajos

Dispozitive automatizate

Modelarea conditiilor in vitro

Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)

Control permanent al produsului

Manipulare in conditii sterile

Contaminare chimica

Referat: Determinarea grasimii din smantana prin metoda acidobutirometrica Referat: Painea - ce paine si in ce cantitate ingrasa?

Contaminare microbiana

Control permanent al mediului

Sterilitatea spatiului de lucru

Controlul incubatorului

Deseuri periculoase, cu risc biologic

Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de cultura

Materiale de unica folosinta

Medii scumpe

Ser fetal de vitel

Instabilitatea genetica

Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

Identificarea dificila a celulelor

Diferente majore intre comportamentul in vivo si in vitro

Tipuri de culturi celulare

Dupa sistemul de cultura

Celule aderente

Celule in suspensie

Dupa tipul celulelor din cultura

Celule normale (nediferentiate, epiteliale, conjunctive)

Celule tumorale

Dupa sursa celulara

Celule embrionare si fetale

Celule din tesuturi adulte (stem sau diferentiate)

Dupa modul de initiere

Culturi primare

Culturi de linii celulare

Dupa dimensiunea culturii

Culturi in conditii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi multicelulare

Culturi la scara industriala (in bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor tehnici de initiere a culturilor de celule

Recoltare

Celulele sunt obtinute din fragmente tisulare sau lichide fiziologice

Recoltarea se face in conditii de asepsie

Prin aspirare

Prin biopsie tisulara

Celulele (tesuturile) sunt transportate spre laborator intr-un timp cat mai scurt, in recipiente speciale, la +40C, in mediu de cultura sau ser fiziologic steril

Izolarea celulelor primare

Metoda de izolare depinde de tipul materialului recoltat si de scopul urmarit

Amestec celular in suspensie (maduva hematopoietica, sange sau alte fluide biologice)

Fragment de tesut cu populatie celulara mixta si MEC (piele, cartilaj, ficat, os etc)  

Metode de izolare

Centrifugare (fluide)

Dispersie mecanica si filtrare (tesuturi solide)

Dispersie enzimatica (cu ajutorul tripsinei, dispazei, colagenzei, elastazei)

Dispersie cu ajutorul chelatorilor de Ca2+(EDTA - acid etilen-diamid-tetraacetic)

Dispersie mixta

1 - tratament mecanic

2 - digestie enzimatica

3 - filtrare

4 - centrifugare

Migrare din fragment de tisut (tesut solid)

Perfuzia organelor intregi (ficat, rinichi, pancreas) cu solutii tamponate de EDTA fara Ca2+ si Mg2+

Migrare din explant

Selectia celulelor din amestecuri celulare

Aderenta selectiva in cultura

Celulele au proprietati de suprafata diferite, exprimand receptori de suprafata diferiti

Modificand conditiile de cultura si suportul de cultura se pot crea conditii pentru aderarea unui anumit tip de celule

Pe o suprafata acoperita cu fibronectina vor adera preponderent celulele precursoare (progenitoare), care exprima in numar mare receptorii integrinici - 1 (progenitori keratinocite, condrocite)

Tehnica de pre-plate permite selectia populatiei de celule stem din tesutul muscular striat sau separarea fibroblastelor usor aderente de alte populatii celulare   

Centrifugarea in gradient de concentratie sau densitate

Se bazeaza pe diferentele de marime si densitate a celulelor

Separarea cu ajutorul metodei de flow-citometrie

Metoda separa cateva populatii celulare simultan dintr-un amestec de mai multe tipuri celulare

Poate separa doar cateva celule din sute, in doar cateva secunde

Se separa in functie de:

Marime

Marcherii specifici (conjugati cu anticorpi specifici)

Cantitatea de proteine

Cantitatea de ADN nuclear

Dezavantajul metodei - greu de asigurat conditiile aseptice