Secventierea ADN

Secventierea ADN

Secventierea ADN reprezinta procesul prin care este determinata ordinea nucleotidelor intr-un fragment ADN. Metoda de secventiere dideoxy sau enzimatica, original dezvolatata de Sanger si colaboratorii sai, utilizeaza ADN polimeraza pentru a sintetiza o copie complementara unei singure catene din proba de ADN. In afara de monocatena ADN si ADN Polimeraza, in amestecul de reactie se adauga un primer care se leaga specific la catena ADN, cele patru deoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in proportii egale, patru dideoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) marcate fluorescent. Dideoxinucleotidele sunt nuclotide sintetice carora le lipseste gruparea -OH de la nivelul atomului C3'. Raportul ddNTP/dNTP din fiecare reactie este ajustat astfel incat fiecare nucleotida sa participe la reactie. Elonagarea catenei ADN se va produce pana cand ADN Polimeraza va insera aleator o dideoxinucleotida in locul unei deoxinucleotide. Extensia catenei este stopata deoarece lipseste gruparea C3'-OH pentru atasarea urmatorarei nucleotide. In final, rezulta un amestec de fragmente cu capatul 5` determinat de primer si capatul 3`terminat cu o ddNTP. Fragmentele rezultate vor diferi in final in lungime doar la nivelul unei perechi de baze, astfel incat fiecare fragment va corespunde, la nivelul ultimei nucleotide, fiecarei nucleotide din fragmentul initial.

Tehnica de secventiere ADN este bazata pe tehnica electroforetica cu gel de poliacrilamida denaturant de rezolutie mare.  Aceste geluri, numite de secventiere sunt capabile de a diferentia o monocatena oligonucleotidica Fragmentele rezultate sunt separate in functie de dimensiuni de la cel mai lung la cel mai scurt. Rezolutia este atat de buna incat se pot difrentia de pana la 800 baze de o singura deoxinucleotida.

Fragmentele genice obtinute prin PCR au fost secventiate pentru a permite analiza genelor ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt.

Initial, ampliconii rezultati prin PCR pentru genele ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt au fost purficati. Daca nu exista benzi sumplimentare care sa denote amplificari nespecifice purificarea ampliconilor se realizeaza direct din produsul PCR utlizind kitul Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega).

Purificarea directa a ADN

1. Se transfera produsii PCR in tuburi Eppendorf de 1,5 mL.
2. Se aduga 100 μL Direct Purification Buffer ;
3. Se vortexeaza si se centrifugheaza (short spin);

4.     Se adauga 1 ml de rasina ce a fost incubata in prealabil 10 minute la 37˚C peste amestecul respectiv si se amesteca bine 20 - 30 de secunde prin vortexare rapida.

5.     Se pregateste o coloana Wizard pentru fiecare amplicon.

6.     Se pipeteaza amestecul rasina-ADN in coloana si apoi aceasta se conecteaza la pompa de vid.

7.     Se indeparteaza pompa de vid si se spala coloana cu 2 ml izopropanol 80 %. Se reconecteaza coloana la vid.

8.     Se usuca rasina prin mentinerea la vid timp de 30 de secunde. Coloana se indeparteaza si se transfera intr-un tub de centrifuga nou.

9.     Se centrifugheaza 2 minute la 10000g pentru a indeparta orice urma de izopropanol.

Referat: Interviu cu Maestrul sportului FIDE Tiberiu Georgescu Referat: Fotbalul la 14-18 ani

10.  Coloana se transfera intr-un alt tub de centrifuga curat, se adauga 50 μl apa PCR si se incubeaza 1 minut la temperatura camerei.

11.  Se centrifugheaza 20 de secunde la 10000g pentru a elua fragmentele de ADN. ADN purificat poate fi pastrat la 4 ⁰C sau la - 20 ⁰C (pentru un timp mai indelungat).

In cazul in care apar amplificari nespecifice, purificarea produsilor PCR se face din gel de agroza LMP (Low Melting Point). In acest sens produsii obtinuti sunt supusi unei electroforeze orizontale, in gel de agaroza LMP 2%, in sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea fragmentelor ADN in gel se realizeaza pe un transiluminator UV. Benzile obtinute pentru fiecare reactie in parte vor fi decupate cu ajutorul unui bisturiu steril, intr-un timp cat mai scurt pentru a minimiza perioada de expunere a ADN la lumina UV. Banda izolata se transfera intr-un tub de centrifuga de 1,5 ml si se incubeaza la 70sC pana la topirea completa a agarozei.

Se adauga 1 ml de rasina ce a fost incubata in prealabil 10 minute la 37˚C peste agaroza topita si se amesteca bine timp de 20 de secunde prin inversare tub. In continuare se urmeaza pasii 5-11 din protocolul de mai sus.

Calitatea si concentratia ADN-ului dupa reactia PCR si purificare a fost evaluata prin determinarea DO la 260/280 nm utlizand spectrofotometrul SmartSpec (BioRad).

Fragmentele PCR purificate si cuantificate spectrofotometric au fost supuse secventierii folosindu-se kitul DNA Sequencing kit - BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready Reaction v3.1 (Applied Biosystems). Secventierea preusupune trei etape: i) amplificarea PCR a ampliconilor cu un singur primer (sens saiu antisens), ii) purificarea produsilor obtinuti in urma PCR de secventiere, iii) incarcarea si rularea probelor pe secventiator ABI PRISM 3130 Genetic Analzer (Applied Biosystems).

Amestecul reactiei PCR secventiere are urmatoarele componente:

la care se adauga proba de ADN diluat corespunzator. Cantitatea optima de ADN pentru reactia PCR de secventere se stablieste in conformitate cu lungimea fragmentului amplificat. (Tabelul 12).

Tabelul 12: Cantitatea ADN pentru reactia PCR

Pentru realizarea reactiilor PCR se programeaza aparatul de PCR (GeneAmp PCR System 9700 - Applied Biosystem) dupa urmatorul program:

Produsii PCR obtinuti au fost precipitati folosind kit-ul de purificare BigDye X-Terminator (Applied Biosystems).

Purificarea produsilor de extensie - metoda de precipitare cu BigDye X-Terminator Purification Kit (Applied Byosistems)

1.     Peste produsii PCR care in prealabil au fost vortexati se adauga 90 μL solutie SAM.

2.     Se adauga 20 μL solutie XTeminator. Inainte de adaugarea solutiei XTerminator este necesara vortexarea acesteia cel putin 10 secunde sau pana cand solutia devine omogena.

3.     Se vortexeaza tuburile 30 minute la 2000 rpm.

4.     Se centrifugheaza tuburile timp de 2 minute la 2000 rpm.

5.     Supernatantul se transfera in placa PCR.

6.     Se pun probele in analizorul genetic automat ABI PRISM 3130.

Secventele nucleotidice obtinute pentru ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt au fost aliniate cu ajutorul programului BioEdit, corectate manual si comparate prin programul BLAST cu secventele existente in bancile de date.