Obtinerea si intretinerea de culturi algale in conditii de laborator

Dupa identificarea ecosistemelor din care urmeaza sa se procure materialul biologic necesar pentru introducerea in cultura si prelevarea unor probe vii, nefixate, se poate pregati izolarea organismelor apartinand speciilor vizate, pentru trecerea lor ulterioara in conditii de crestere, in laborator.

Izolarea unor organisme algale in vederea obtinerii unor culturi pure se face plecand de la probe recoltate dintr-un bazin acvatic, probe care de regula contin un numar mare de populatii algale, apartinand la specii foarte diferite.

Prima faza de lucru consta, evident, in examinarea probelor la microscop, pentru a se stabili compozitia calitativa a comunitatii respective; in functie de situatie se pot cauta si anumite specii, care prezinta interes. Va fi utila, in vederea stabilirii procedurilor de dilutie, determinarea densitatii populationale la specia/speciile care ne intereseaza. Pentru aceasta se vor folosi metodele prezentate si aplicate la lucrarile de laborator de la cursul "Productia primara" (Masterat - anul I).

Se recomanda ca din proba initiala, dupa omogenizare sa se separe o subproba, care sa fie fixata si pastrata in colectie. Ea va servi ca "proba martor" pentru compozitia initiala a comunitatii; va putea, de asemenea, sa fie utila pentru compararea morfologica si dimensionala a celulelor crescute pe parcursul timpului in conditii de cultura, eventual in medii nutritive variate, cu celulele initiale apartinand speciei respective.

In faza urmatoare se realizeaza o cultura bruta; aceasta se poate face in variante paralele, cu medii nutritive variate. In functie de cerintele ecofiziologice ale speciilor, se va ajunge la predominarea unei specii sau a alteia.

Din aceste culturi brute se poate face apoi izolarea speciilor care prezinta interes.

Izolarea se face prin mai multe metode.

Una dintre cele mai precise se bazeaza pe utilizarea dispozitivelor de tip micromanipulator: lucrandu-se sub microscop, se poate preleva chiar si o singura celula apartinand speciei cautate.

In cadrul lucrarilor de laborator vom utiliza o alta metoda - cea a dilutiilor succesive.

In principiu, metoda se bazeaza pe scaderea densitatii populatiilor prin diluarea repetata, astfel ca sa se ajunga la o densitate de ordinul unei singure celule/ml, de exemplu. Folosind ca inocul o cantitate - de 1 ml, de exemplu - se poate obtine o cultura monospecifica. Pentru siguranta reusitei, se vor face inoculari paralele in mai multe vase de cultura.

Pentru exemplificare, sa presupunem ca in cultura bruta, dupa mentinerea ei in conditii de laborator, am identificat prezenta a trei populatii de alge si am determinat densitatea numerica a fiecareia:

Populatia 1 -  14800 celule/ml

Populatia 2 -      350 celule/ml

Populatia 3 -  11540 celule/ml.

Dupa omogenizare, prelevam l ml din aceasta cultura bruta si-l folosim ca inocul, introducandu-l intr-un recipient care contine acelasi mediu nutritive, in cantitate de 99 ml.

In acest fel, densitatile respective devin:

Populatia 1 - 148  celule/ml

Populatia 2 -   3,5 celule/ml

Populatia 3 -  115 celule/ml

La urmatoarea diluare, in acelasi raport (1/100), se ajunge la densitatile:

Populatia 1 -  1,48 celule/ml

Populatia 2 -  0 celule/ml

Populatia 3 - 1,1   celule/ml

Aceste variante de cultura de laborator vor sta la baza obtinerii unor culturi monoalgale. Pentru siguranta, dupa o perioada de 5-10 zile, se va proceda la verificarea compozitiei culturii; in cazul ca in mediul nutritive a(u) aparut si alta(e) specii de alge, operatia descrisa mai sus se repeat, pana se ajunge la o cultura monospecifica.

Dupa obtinerea unei culturi pure, care contine numai specia de alge care ne interesaza, este necesara multiplicarea acestei culturi, in scopul obtinerii unei reserve necesare de material biologic selectionat.

Multiplicarea este necesara pentru a dispune de o rezerva de siguranta, utila in cazul aparitiei unor situatii nedorite (infectarea unei culturi, spargerea  accidentala a unui vas de cultura etc), cat si in contextul unor activitati didactice sau al unor proiecte de cercetare, cand poate apare nevoia de a dispune deodata de o cantitate mai mare de material biologic selectionat.

Periodic este, evident, necesara verificarea puritatii tuturor culturilor de laborator.

Precizam ca este indispensabila pastrarea unei evidente clare si precise a culturilor de laborator obtinute; identitatea fiecarei culturi trebuie stabilita imediat si cu prezizie.

Pentru aceasta, fiecare vaz de cultura va primi un numar de cod propriu, nerepatabil; in registrul (baza de date) referitoare la culturile realizate, acestui cod ii vor corespunde urmatoarele informatii:

indicativul de colectie (codul);

specia de alga pastrata;

locul prelevarii;

Analiza: Pancreasul endocrin - capilare si acini serosi Referat: Generalitati despre nucleul celulei

data prelevarii;

data izolarii;

cine a facut izolarea;

mediul nutritive in care este pastrata cultura;

numarul de repetitii (variante paralele) ale aceleiasi culturi;

ultima improspatare a mediului nutritive (daca este cazul).

Astfel, pentru specia Scendesmus quadricauda, de exemplu, pa vasul de cultura va apare notatia:

Sce.qu.- 151

Apeland la registrul colectiei, la codul respective gasim informatiile necesare:

Populatia respectiva de Scenedesmus quadricauda, cu numarul de ordine 151 a fost izolata din ecosistemul "lacul de baraj Galbeni", de exemplu, de cine a fost izolata, cand, si ca este pastrata in mediul nutritiv Knop, de pilda.

In cazul ca avem mai multe culturi, paralele, (repetitii) din aceeasi specie si aceeasi linie de provenienta, acestea vor putea primi numere derivate (subordonate), de ex.

Sce.qu.151.1;  Sce.qu.151.2 etc.

Pentru pastrarea in laborator a culturilor pentru o perioada mai lunga de timp este necesara asigurarea unor conditii de mediu care sa corespunda cerintelor ecofiziologice ale fiecarei specii de alge.

In ceea ce priveste conditiile fizice ale mediului de crestere, mentionam ca temperatura mediului ambient trebuie sa fie de regula situata la limita inferioara a intervalului termic optim pentru specia respectiva. Se considera oportuna aceasta optiune, intrucat in cazul pastrarii indelungate a culturilor in conditii de laborator nu se urmareste obtinerea unei bioproductivitati ridicate, ci numai supravietuirea, in conditii de sanatate (normalitate fiziologica) a unor "populatii" monospecifice de alge, utilizabile la un moment sau altul pentru dezvoltarea unor culturi mai consistente.

La modul general, se recomanda pastrarea culturilor permanente de alge la temperaturi de ordinul a 13-15⁰ C; pentru speciile termofile sau pentru cele criofile se stabilesc gradientii termici corespunzatori.

Cel de la doilea factor fizic major - lumina - trebuie sa permita derularea normala a proceselor de fotosinteza la nivel minim, de supravietuire; pentru aceasta, in mod obisnuit  culturile "permanente" (respectiv colectiile de culturi) se pastreaza la intensitati ale luminii de ordinul a 2000 - 3000 luxi.

In practica, se poate utiliza fie lumina solara, dar evitandu-se expunerea directa la soare, fie sisteme artificiale de luminare, bazate pe tuburi fluorescente cu lumina alba. In acest caz, regimul de iluminare poate fi de 10 ore lumina/14 ore intuneric.

In ceea ce priveste compozitia chimica a mediilor de crestere, aceasta este foarte variata; in cadrul partii teoretice a prezentului curs au fost prezentate mai multe tipuri de retete, adecvate diferitelor cerinte metabolice sau feluri de alge.

Precizam totusi ca unul dintre cele mai frecvent utilizate medii nutritive pentru mentinerea indelungata a unor culturi de alge in conditii de laborator, este mediul PRAT, cu urmatoarea compozitie:

Un alt mediu de uz general, nespecific, larg utilizat pentru mentinerea unor culturi de alge vii in laborator, este mediuy BBM (cf. Nichols & Bold) :

Intretinerea culturilor de alge pastrate in conditii de laborator ca surse de material biologic selectionat, cu provenienta si caracteristici cunoscute, consta in principal in efectuarea urmatoarelor operatiuni:

verificarea periodica a situatiei populatiei de alge din fiecare cultura (de regula, lunar)

verificarea periodica a puritatii culturii - pentr a depista la timp eventuala aparitie a unor specii straine (alte alge, protozoare, ciuperci microscopice) si a lua masurile corespunzatoare;

improspatarea periodica a mediului nutritiv (dupa situatie, la 4-6 luni).

* *

Inainte de a incheia prezentarea acestei lucrari practice, trebuie sa amintim ca exista si o solutie principial diferita, o alternativa la pastrarea unor culturi de alge in conditii de laborator.

Este vorba despre folosirea unor tehnici ce vizeaza, in esenta, mentiunerea/pastrarea unor microorganisme vegetale intr-o stare de "viata latenta" (sare numita uneori si "anabioza"), care permite trecerea ulterioara - uneori dupa o perioada indelungata - la o stare fiziologica activa, normala, respectiv derularea ciclului obisnuit de viata si reproducerea algelor.

Pentru aceasta s-au testat, cu bune rezultate, tehnici de pastrare a materialului biologic in stare congelata, prin procedee speciale de inghetare profunda, procedee de liofilizare etc.  

Pentru Spirulina platensis, spre exemplu, s-a experimentat congelarea profunda prin scaderea treptata a temperaturii suspensiei algale pana la - 60⁰ C, in prezenta unor aditivi organici speciali, capabili sa asigure conditiile tehnice necesare pentru protectia celulelor fata de eventualele leziuni produse in procesul de congelare. S-a observat ca viabilitatea maxima a algelor s-a inregistrat la culturi tinere, crescute anterior la un nivel ridicat de luminare. Rezultate bune s-au obtinut si in cazul uscarii prin congelare ("freeze drying") la aceasta specie de alge, cat si la altele, de altfel.

Avantajul aplicarii unor astfel de tehnici consta in aceea ca sunt eliminate practice activitatile de intretinere, verificare, improspatare a mediilor nutritive practicate in culturile de colectie, activitati costisitoare ca timo si ca mijloace. Un al doilea avantaj consta in eliminarea pericolului de contaminare a culturilor pe timpul pastrarii lor in laborator.