Analiza fitochimica preliminara a produsului medicinal Hippophaë fructus

Analiza fitochimica preliminara a produsului medicinal Hippophaë fructus

1. Material si metoda

Materialul vegetal a fost reprezentat de fructele recoltate de la Hippophaë rhamnoides. Separarea grupelor de principii active a fost efectuata prin extractia succesiva si selectiva a produselor vegetale cu solventi de polaritati diferite. Initial, produsele vegetale sunt extrase cu un solvent nepolar (eter etilic), apoi cu un solvent polar (metanol) si in final cu apa, obtinand trei solutii extractive.

1. 1. Analiza extractului eteric

1 g produs vegetal pulverizat la sita V s-a extras, in aparatul Soxhlet, cu 100 ml eter etilic, pana ce solutia eterica nu a mai lasat reziduu prin evaporare. Dupa filtrarea extractului eteric s-au efectuat reactiile de identificare pentru urmatoarele grupe de principii active: ulei volatil, lipide, steroli, triterpene, carotenoide, acizi grasi, acizi rezinici, alcaloizi baze, agliconi flavonici, emodoli, cumarine.

Identificarea uleiului volatil

20 ml extract eteric se distila la sec intr-un aparat de tip rotavapor. Reziduul prezinta un miros neplacut, caracteristic. Acesta s-a extras cu 2 ml alcool etilic, fractionat. Prin concentrarea solutiilor alcoolice s-a obtinut un reziduu cu acelasi miros neplacut. Este posibila prezenta uleiului volatil, confirmarea analizei fiind realizata prin metoda NeoClevenger.

Identificarea lipidelor

Reziduul ramas de la extractia uleiului volatil cu etanol se trateaza cu 10 ml solutie alcoolica KOH 0.5 M si se fierbe la reflux, pe baia de apa, 1-2 ore, pana ce la suprafata nu se mai observa picaturi uleioase. Se distila alcoolul, iar reziduul se dizolva in 15-20 ml apa distilata fierbinte, care se aduce intr-o palnie de separare. Balonul se spala de mai multe ori cu cantitati mici de apa distilata fierbinte, care se aduc in aceeasi palnie de separare. Dupa racirea balonului, acesta se spala de doua ori cu eter etilic. Solutiile eterice se aduc in palnia de separare peste solutia apoasa racita si se agita pentru extragerea compusilor insaponifiabili.

Extractia se repeta de doua ori cu cate 5 ml eter etilic. Extractele eterice reunite se deshidrateaza pe Na₂SO₄ sicc. In extractul eteric deshidratat se pot identifica: steroli, triterpene si carotenoide.

In palnia de separare ramane solutia apoasa alcalina, care contine saruri de potasiu ale acizilor grasi superiori, flavonelor (solutie colorata in galben) si antrachinonelor (solutie rosie).

Identificarea sterolilor si triterpenelor

5 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 0.5 ml cloroform, apoi se adauga 0.5 ml anhidrida acetica.

Solutia obtinuta se trece intr-o eprubeta uscata dupa care, cu ajutorul unei pipete, se aduc la fundul eprubetei 1-2 ml H₂SO₄ conc.

La zona de contact a celor doua lichide apare un inel violet, iar stratul superior se coloreaza, dupa 5-10 min., in verde-albastru sau violet datorita prezentei sterolilor sau triterpenelor (reactia Liebermann-Burchard).

Identificarea carotenoidelor

5 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se trateaza cu 2-3 picaturi reactiv Carr-Price. Aparitia unei coloratii albastre care trece in rosu indica prezenta carotenoidelor. Cu H₂SO₄ conc. carotenoidele se coloreaza in albastru intens sau verde-albastru.

Identificarea acizilor grasi

Solutia apoasa alcalina din palnia de separare se trateaza cu HCl conc. pana la pH 3-4. Solutia apoasa acida devine opalescenta datorita acizilor grasi, care se extrag prin agitare repetata cu eter etilic sau eter de petrol (de 3 ori cu cate 10 ml).

Extractele eterice reunite se deshidrateaza pe Na₂SO₄ sicc. Daca prin  concentrarea extractului eteric se obtine un reziduu onctuos, atunci sunt prezenti acizii grasi.

Identificarea acizilor rezinici

Daca prin acidularea solutiei apoase alcaline epuizata de substantele insaponifiabile apare un precipitat, o mica portiune din acesta se dizolva in eter de petrol si se verifica prezenta acizilor rezinici cu ajutorul reactiei Hirschsohn. Solutia eterica se agita intr-o eprubeta cu 5 ml solutie acetat de cupru 1%.

Daca sunt prezenti acizii rezinici, stratul eteric se coloreaza in albastru-verzui pana la albastru datorita rezinatilor de cupru.

Extractul eteric initial nesaponificat ramas (30 ml) este utilizat in continuare pentru identificarea: alcaloizilor baza, agliconilor flavonici, emodolilor, sterolilor, triterpenelor si carotenoidelor.

Identificarea alcaloizilor baza

10 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 1.5 ml solutie HCl 2%, prin amestecare cu o bagheta de sticla, la cald, pe baia de apa. Solutia decantata sau filtrata se imparte in trei eprubete, in volume egale.

Intr-una din eprubete se adauga reactiv Mayer, in a doua 2-3 picaturi de reactiv Bertrand, iar ultima eprubeta serveste ca martor.

Daca probele tratate cu reactivii mentionati dau precipitate evidente, alb-galbui, atunci sunt prezenti alcaloizii.

Identificarea agliconilor flavonici

5 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 1-2 ml metanol 50%, la cald, pe baia de apa.

Solutia de culoare galbena se aduce intr-o eprubeta, se adauga putina pulbere de Mg si 10 picaturi de HCl conc.

Aparitia unei coloratii rosii indica prezenta agliconilor flavonici (reactia Shibata).

Identificarea emodolilor

5 ml extract eteric se aduc intr-o eprubeta, se adauga 1 ml solutie NaOH 10% si se agita. Daca solutia alcalina se coloreaza in rosu-visiniu, atunci sunt prezenti derivatii antrachinonici (emodoli) liberi sau sub forma oxidata (reactia Bornträger).

Identificarea cumarinelor

5 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 1-2 ml apa distilata fierbinte. Dupa racire solutia se imparte in doua eprubete. Una din eprubete serveste ca martor, pe cand in cealalta se adauga 0.5 ml solutie hidroxid de amoniu 10%. Ambele eprubete se examineaza in lumina UV (λ 265 nm). Aparitia unei fluorescente albastra-verzuie sau violeta, mai intensa in proba alcalinizata, confirma prezenta cumarinelor.

Verificarea prezentei cumarinelor se face prin reactia Feigl-Frehden-Anger, care pune in evidenta lactona hexaatomica din structura acestora: extractele apoase cercetate in UV se aduc intr-o capsula de portelan, se adauga 3-5 picaturi solutie de clorhidrat de hidroxilamina 0.5 M, in prezenta KOH 10%, la pH 8-9. Se aduce la reziduu, care se dizolva apoi in HCl 10%, adaugat pana la pH 3-4, la care se aduc 1-2 picaturi solutie FeCl₃ 3%. Aparitia unei coloratii violete fugace pune in evidenta prezenta cumarinelor.

Identificarea sterolilor, triterpenelor si carotenoidelor, din extractul eteric nesaponificat ramas, s-a efectuat prin reactiile descrise anterior.

1. 2. Analiza extractului metanolic

Produsul vegetal ramas de la extractia cu eter se aduce intr-un balon cu refrigerent ascendent. Se adauga 150 ml metanol si se extrage la cald, pe baia de apa, timp de 20-40 min.

Extractul alcoolic se concentreaza la 50 ml intr-un rotavapor. Metanolul extrage din produsele vegetale degresate urmatoarele grupe de principii active: polifenoli si heterozide polifenolice (antracenozide, cumarine, flavonoide), compusi reducatori, alcaloizi saruri, aminoacizi, glicozide sterolice si triterpenice.

Referat: Celula - esenta vietii (fenomene biotice) Referat: Fuel Cells (Celulele de combustibil)

Principiile active se identifica prin reactii specifice executate pe extractul alcoolic ca atare sau in prealabil hidrolizat.

Reactii efectuate pe extractul metanolic

Identificarea taninurilor

1 ml extract alcoolic adus intr-o eprubeta se dilueaza cu 2 ml apa distilata, apoi se adauga 2-3 picaturi solutie FeCl₃ 1% diluata 1 : 10. Aparitia unei coloratii albastre-negricioase indica prezenta taninului galic, iar o coloratie verde-negricioasa atesta prezenta taninului catehic.

In cazul unui amestec de taninuri galice si catehice se recurge la separarea acestora cu ajutorul reactivului Styassny: 10 ml extract apos se fierbe la reflux cu 3 ml reactiv Styassny, timp de 30 min.

In aceste conditii, taninul catehic se condenseaza si se depun sub forma unui precipitat rosu, care se separa prin filtrare.

In filtrat, dupa neutralizare cu acetat de sodiu in exces, se aduce solutia de FeCl₃ diluata (2-3 picaturi). Aparitia unei coloratii albastre indica prezenta taninului galic.

Identificarea compusilor reducatori

1 ml extract alcoolic se aduce intr-o eprubeta, se dilueaza cu 2 ml apa distilata, se adauga 1 ml reactiv Fehling (I + II) si se incalzeste la fierbere timp de 10 min. Aparitia unui precipitat rosu-caramiziu de oxid cupros indica prezenta compusilor reducatori.

Identificarea alcaloizilor saruri

15 ml extract metanolic se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 5-10 ml solutie HCl 2%, prin amestecare cu o bagheta de sticla, la cald. Solutia acida decantata se aduce intr-o palnie de separare si se adauga NH₃ conc. pana la pH 8-10.

Solutia alcalina se extrage cu eter etilic (3×10 ml). Extractul eteric, spalat cu apa distilata, se separa, se anhidrizeaza (prin trecere pe Na₂SO₄ sicc.) si se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa.

Reziduul se dizolva in 1.5 ml solutie HCl 2%, iar portiunea acida decantata se imparte in trei eprubete, la volume egale. Intr-una din probe se adauga 2-3 picaturi reactiv Mayer, in cea de­a doua 2-3 picaturi reactiv Bertrand, a treia proba servind drept martor. Daca probele tratate cu reactivii mentionati dau precipitate evidente, alb-galbui, sunt prezenti alcaloizii.

Identificarea bazelor alcaloidice cuaternare si a amino-oxizilor

Solutia apoasa alcalina ramasa de la extractia alcaloizilor cu eter etilic se aciduleaza cu HCl conc. la pH 3, se filtreaza, dupa care se efectueaza reactiile de precipitare Mayer si Bertrand. Aparitia unui precipitat indica prezenta bazelor alcaloidice cuaternare si a amino-oxizilor.

Identificarea aminoacizilor

5 ml extract metanolic se evapora la sec intr-o capsula de portelan. Reziduul se reia cu 1.5 ml apa distilata, la cald, se filtreaza intr-o eprubeta si se adauga 10 picaturi solutie acetonica de ninhidrina 1%. Se incalzeste pe baia de apa, la fierbere, 20-25 minute Aparitia unei culori violete sau albastre-violete indica prezenta aminoacizilor.

Reactii efectuate pe extractul metanolic hidrolizat

25 ml extract metanolic se fierbe la reflux 30 minute cu 15 ml solutie HCl 10%. Se distila metanolul intr-un rotavapor. Solutia apoasa acida, care uneori devine opalescenta, se aduce intr-o palnie de separare si se supune extractiei cu 3 × 15 ml eter etilic. Prin separare se obtine extractul eteric, care se deshidrateaza pe NaSO₄ sicc. si solutia apoasa acida.

In extractul eteric se pot identifica urmatoarele grupe de principii active: antracenozide, cumarine, heterozide cardiotonice, saponozide sterolice si triterpenice, flavonozide, proantocianidoli. In solutia apoasa acida se pot identifica antocianozidele si taninul catehic (uneori polimerizat la flobafene).

Identificarea antracenozidelor

Se face prin reactia Bornträger, pe 3 ml extract eteric.

Identificarea cumarinelor

Pe baza fluorescentei in UV si prin reactia Feigl-Frehden-Anger.

Identificarea heterozidelor cardiotonice

Are la baza reactii prin care se pun in evidenta nucleul sterolic, lactona penta- sau hexaatomica si ozele specifice. Nucleul sterolic se identifica pe baza reactiei Liebermann-Burchard. Lactona pentaatomica nesaturata din structura cardenolidelor se pune in evidenta cu ajutorul unor reactii de culoare:

▪ reactia Kedde - 10 ml extract eteric se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa; reziduul se dizolva in 1-2 ml metanol, se adauga 1-2 ml solutie alcoolica de KOH 1 M si apoi 3-4 picaturi solutie de acid 3,5-dinitrobenzoic 1%; la incalzire se obtine o coloratie violeta fugace.

▪ reactia Legal - cu nitroprusiat de sodiu in mediu alcalin.

▪ reactia Raymond - cu m-dinitrobenzen in mediu alcalin.

Partea glucidica se identifica prin reactia Keller-Kiliani sau Pesez, ultima fiind caracteristica 2-dezoxiozelor (cu solutie de xanthidrol 1%).

Identificarea saponozidelor

Pentru nucleul sterolic sau triterpenic se efectueaza reactia Liebermann-Burchard.

Pentru sterolii nesaturati se efectueaza testul Salkovski, cu H₂SO₄ conc., cand apare o coloratie sau un inel rosu-visiniu la limita celor doua lichide.

Saponozidele se identifica prin proba de spumefiere si prin hemoliza, pe solutia apoasa rezultata prin dizolvarea reziduului obtinut prin concentrarea extractului alcoolic nehidrolizat.

Identificarea flavonozidelor

Pentru flavonozide este caracteristica reactia Shibata (sau a cianidolului): 5 ml extract eteric se evapora la sec intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se dizolva in 2 ml metanol 50%, la cald. Solutia de culoare galbena se aduce intr-o eprubeta, se adauga cateva mg de Zn pulbere si 10 picaturi HCl conc.

Aparitia unei coloratii rosii sau portocalii indica prezenta agliconilor flavonozidelor. Culoarea rosie este caracteristica flavonolilor, iar cea portocalie flavonelor.

Identificarea proantocianidolilor

La 5 ml extract alcoolic se adauga 0.5 ml HCl conc. si se incalzeste 5 minute. Daca apare o coloratie rosie-violeta sunt prezenti proantocianidolii.

Identificarea antocianozidelor

Daca solutia apoasa acida are o culoare rosie, care la pH 7 trece in violet, iar in mediu alcalin in albastru sau verde, sunt prezente antocianozidele.

Identificarea taninului catehic

Cand solutia apoasa acida contine un precipitat rosu-brun, a carui culoare se mentine si in mediu alcalin este posibila prezenta taninului catehic.

1. 3. Analiza extractului apos

Produsul vegetal ramas de la extractia cu metanol se usuca si apoi se extrage prin fierbere cu 50-100 ml apa distilata, timp de 15 min. Solutia apoasa filtrata se concentreaza la 50 ml, in aceasta putand fi identificate urmatoarele principii active: glucide (oze, poliholozide omogene, poliuronide), heterozide (saponozide), taninuri, substante proteice, alcaloizi saruri.

Identificarea poliuronidelor

2 ml solutie extractiva apoasa se toarna in fir subtire intr-o eprubeta care contine 10 ml acetona. Daca se formeaza un precipitat voluminos (floconos), acesta este separat prin filtrare.

Se spala apoi cu acetona si se coloreaza cu un reactiv specific (hematoxilina, albastru de toluidina, albastru de metilen). Colorarea precipitatului in violet sau albastru indica prezenta mucilagiilor.

Identificarea compusilor reducatori

Intr-o eprubeta se aduce 1 ml solutie extractiva apoasa, se adauga 5-8 picaturi reactiv Fehling (I + II) si se incalzeste la fierbere.

Aparitia unui precipitat rosu-caramiziu, de oxid cupros, evidentiaza prezenta compusilor reducatori.

Identificarea ozelor si poliozelor

2 ml solutie extractiva apoasa se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de apa. Reziduul se trateaza cu 2-3 picaturi H₂SO₄ conc. Dupa un repaus de 3-4 min., se adauga 3-4 picaturi solutie alcoolica de albastru de timol 1%.

Aparitia unei coloratii rosii indica prezenta ozelor sau poliozelor. 1 ml solutie extractiva apoasa se trateaza cu 1-2 picaturi de reactiv Lugol. Aparitia unei coloratii albastre indica prezenta amidonului.

Identificarea saponozidelor

Reactia Liebermann-Burchard, testul de spumefiere si hemoliza sunt metode de identificare specifice saponozidelor.

Testul de spumefiere se executa dupa cum urmeaza: 1 ml extract apos se dilueaza cu 9 ml apa; 4 ml solutie diluata, se aduc intr-o eprubeta cu diametrul de 1.5 cm si se agita timp de 15 s.

Aparitia unei coloane de spuma inalta de minim 1 cm, persistenta cel putin 15 min., indica prezumptiv prezenta saponozidelor. Testul hemolizei se efectueaza prin metoda gelatin-sange.

Identificarea taninurilor

1 ml solutie extractiva apoasa se trateaza cu 1-2 picaturi solutie FeCl₃ 1%, diluata 1 : 10. Aparitia unei coloratii albastre inchis indica prezenta taninurilor galice, iar o coloratie verde inchis confirma prezenta taninurilor catehice. In cazul unui amestec de taninuri galice si catehice se foloseste reactivul Styassny.

Identificarea alcaloizilor saruri

15 ml extract apos se alcalinizeaza cu solutie de hidroxid de amoniu 10%, la pH 8-10 si se extrage cu eter etilic 3 × 15 ml. In continuare, se aplica aceeasi tehnica de lucru folosita pentru identificarea alcaloizilor din extractul metanolic.

2. Rezultate si discutii

Rezultatele analizei fitochimice preliminare a extractelor eteric, metanolic si apos din fructele de Hippophaë rhamnoides sunt prezentate in Tabelele 1-3:

▪ steroli, triterpene, carotenoide, acizi grasi, agliconi flavonici (extractul eteric);

▪ compusi reducatori, flavonozide (extractul metanolic);

▪ poliuronide, compusi reducatori, oze (extractul apos).

Tabelul 1 - Analiza fitochimica preliminara a extractului eteric

Tabelul 2 - Analiza fitochimica preliminara a extractului metanolic

Tabelul 3 - Analiza fitochimica preliminara a extractului apos